【摘 要】
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【目的】获得具有体外切割活性的来自毛螺旋菌属（Lachnospiraceae） ND2006的LbCas12a蛋白,以期为LbCas12a的应用研究提供重要的生物学工具。【方法】根据pMBP-LbCas12a质粒（Addgene,113431）的基因序列合成LbCas12a基因,并将其与pET-28a（+）线性化载体进行同源重组,构建重组质粒pET28a-LbCas12a,经测序和NheⅠ、Sal
【机 构】
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华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室
【基金项目】
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武汉市应用基础前沿项目（2020020601012255）； 国家自然科学基金（31772563）；
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【目的】获得具有体外切割活性的来自毛螺旋菌属（Lachnospiraceae） ND2006的LbCas12a蛋白,以期为LbCas12a的应用研究提供重要的生物学工具。【方法】根据pMBP-LbCas12a质粒（Addgene,113431）的基因序列合成LbCas12a基因,并将其与pET-28a（+）线性化载体进行同源重组,构建重组质粒pET28a-LbCas12a,经测序和NheⅠ、SalⅠ双酶切鉴定后将阳性重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中进行IPTG诱导表达。通过12%SDS-PAGE凝胶电泳检测确定IPTG诱导的最佳浓度及温度,鉴定重组蛋白的表达形式,通过Ni-NTA树脂亲和层析的方法进行纯化、超滤法浓缩,BCA法检测蛋白浓度。将浓缩后的LbCas12a与猪细小病毒（PPV）靶标DNA、CRISPR RNA （crRNA）及偶联荧光基团的非特异性单链DNA（ssDNA）探针FQ共孵育,设置1个无LbCas12a蛋白的对照组、4个不同蛋白浓度（125、250、500、1 000 nmol/L）的试验组,检测不同组别ssDNA探针的荧光强度,检测测试位点PPV活性。【结果】测序和NheⅠ、SalⅠ双酶切鉴定结果表明,重组质粒pET28a-LbCas12a构建成功且无移码突变。12%SDS-PAGE凝胶电泳检测结果表明,IPTG诱导表达的最佳浓度为0.5 mmol/L,最佳温度为37℃,表达形式主要为可溶性表达。蛋白浓度检测结果表明,浓缩后的蛋白浓度为485 ng/μL,质量为143 ku。活性检测结果表明,125、250、500、1 000 nmol/L LbCas12a蛋白组的荧光强度均极显著高于对照组（P<0.01）。【结论】本研究成功表达出高活性的LbCas12a蛋白,且LbCas12a蛋白具有体外切割ssDNA的反式活性,为后续基于CRISPR-LbCas12a系统的分子检测技术奠定了基础。
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