【摘 要】
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[目的]HSP90是热休克蛋白家族的成员之一,在昆虫的抗逆性和变态发育中发挥重要作用,已有研究表明HSP90能够促进家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)的增殖,但作用机制尚不清楚.本研究通过鉴定BmHSP90的相互作用蛋白,为其促进BmNPV增殖的作用机制解析提供参考.[方法]构建连接在pIZ/V5-His的BmHSP90HA真核过表达载体,在家蚕BmN-SWU1细胞中转染48 h后,感染BmNPV继续培养48 h后收集蛋白,保留总蛋白后将这些蛋白
【机 构】
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西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室,重庆400716;西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室,重庆400716;西南大学农业农村部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室,重庆400716
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[目的]HSP90是热休克蛋白家族的成员之一,在昆虫的抗逆性和变态发育中发挥重要作用,已有研究表明HSP90能够促进家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)的增殖,但作用机制尚不清楚.本研究通过鉴定BmHSP90的相互作用蛋白,为其促进BmNPV增殖的作用机制解析提供参考.[方法]构建连接在pIZ/V5-His的BmHSP90HA真核过表达载体,在家蚕BmN-SWU1细胞中转染48 h后,感染BmNPV继续培养48 h后收集蛋白,保留总蛋白后将这些蛋白均分两管,进行免疫共沉淀,分别用抗HA抗体和IgG抗体钓取相互作用蛋白,对蛋白胶进行硝酸银染色后,获取差异条带并做质谱分析,将质谱结果与信息分析结合进行候选互作蛋白筛选,并克隆鉴定互作蛋白.通过免疫荧光验证HSP90与互作蛋白的共定位情况,并进一步采用免疫共沉淀试验确定其是否存在相互作用关系.[结果]硝酸银染色结果显示,试验组与对照组在90、70和60 kD附近处存在差异条带,并验证了 90 kD处的差异条带为诱饵蛋白;将另外两条差异带进行质谱分析,共鉴定到7个候选相互作用蛋白,通过分析选择其中两个候选蛋白作后续研究,分别为Tubulin-specific chaperone E(Tbce)和 Golgin subfamily A member 5(Golga5).BmTbce的最大开放阅读框长度为 1728 bp,编码576个氨基酸,BmGo1ga5的最大开放阅读框长度为1 854 bp,编码618个氨基酸;同源比对和系统进化树显示BmTbce的微管结合结构域(cytoskeleton-associated protein-glycine-rich,CAP-Gly)位于N端且在不同物种之间保守性较高,BmGo1ga5的跨膜区(transmembrane domain,TMD)位于C端,也较为保守;荧光共定位显示BmHSP90与BmTbce和BmGo1ga5在细胞质中发生共定位,并进一步通过免疫共沉淀证明BmHSP90HA和BmTbceFlag、BmHSP90HA和BmGo1ga5Flag具有相互作用关系.[结论]经过筛选与鉴定,在BmNPV感染家蚕细胞的过程中,与家蚕热休克蛋白HSP90发生相互作用的蛋白为BmTbce和BmGo1ga5.
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