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摘要：以黄瓜绿斑驳花叶病毒为检测对象，应用黄瓜绿斑驳花叶病毒的特异性抗体，以稀土荧光纳米颗粒为标记物，制备黄瓜绿斑驳花叶病毒荧光纳米颗粒试纸条，建立高效、灵敏、准确检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的荧光免疫技术体系，旨在研发一种可用于快速、便捷检测黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的检测方法。
关键词：黄瓜绿斑驳花叶病毒；荧光纳米颗粒；试纸条；免疫层析
中图分类号： S436.421.1 9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0152-02
黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是葫芦科作物上重要的植物检疫性病毒，主要分布在欧洲、印度和日本等，严重威胁着西瓜、甜瓜、黄瓜等葫芦科作物的生产，一般减产约15%[1]。2005年辽宁省盖州市西瓜感染了黄瓜绿斑驳花叶病毒，损失惨重，此后在广西、辽宁、河北、山东、广东和北京等地陆续发现疫情，已严重威胁西瓜、甜瓜、黄瓜等作物的生产，因此加强该病毒的检测极为重要。快速检测技术是有效防止黄瓜绿斑驳花叶病毒疫情扩散的重要保障，而现有检测该病毒的方法多为酶联免疫吸附（ELISA）法，该方法可在短时间内检测大量样品，但对检测环境、人员素质及设备等条件要求较高，且血清价格昂贵，不能满足现场快速检测的需要。此外，人们先后研究出多种快速诊断方法，如聚合酶链式反应RT-PCR[2]、免疫捕获RT-PCR（IC-PT-PCR）[3]、实时荧光RT-PCR[4]等，但这些分子生物学检测方法均具有费用昂贵、操作繁琐的缺点，不能满足一线检测人员或田间检测的需求。因此，本研究以黄瓜绿斑驳花叶病毒为检测对象，应用黄瓜绿斑驳花叶病毒的特异性抗体，以稀土荧光纳米颗粒为标记物，制备黄瓜绿斑驳花叶病毒免疫层析试纸条，建立快速、灵敏、准确检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的荧光免疫技术体系。
1材料与方法
1.1材料
牛血清白蛋白（BSA）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；羊抗鼠IgG购自中晶生物技术有限公司；硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜购自美国Millipore公司，所用试剂均为分析纯。荧光纳米颗粒购自深圳易瑞生物技术有限公司。
1.2方法
1.2.1黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的制备参照曹洁等的方法[5]。
1.2.2单克隆抗体的纯化将腹水20 000 g离心 30 min，取上清，往所得上清中逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，室温搅拌30 min，将液体置于4 ℃冰箱中静置过夜；4 ℃，10 000 g离心30 min，弃上清，用pH值为7.4的PBS重悬沉淀，将所得溶液用Protein A柱进行纯化，用PBS（pH值为7.4）滤洗所得产物3次，往透析后的产物中加入海藻糖，使海藻糖的终浓度为5%，100 μL/支分装待用。
1.2.3抗体与颗粒共价偶联取荧光颗粒50 μL，用 50 mmol/L MES（pH值为6.0）洗涤颗粒2次，每次1 mL；用600 μL 50 mmol/L MES（pH值为6.0）重悬颗粒；加入100 mg/mL sulfo-NHS和EDC各200 μL，室温摇动30 min；离心，弃上清；用1 mL 50 mmol/L MES（pH值6.0）洗涤颗粒1次；用1 mL 50 mmol/L MES（pH值6.0）重悬颗粒；加入适量纯化后的黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体，室温振摇1 h；加入等体积的PBS-BSA（BSA含量2%，pH值7.4），继续反应1 h；离心，弃上清；用50 mmol/L MES（pH值6.0）洗涤颗粒3次，1 mL/次；用300 μL重悬液[10 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）、10%蔗糖]重悬颗粒，4 ℃保存，备用。
将单抗梯度稀释后，分别取50、100、150、200、250、300 μg单抗溶液，按上述方法与荧光纳米颗粒偶联，用BCA蛋白检测试剂盒检测偶联后的上清中抗体的浓度并筛选出最佳抗体浓度。
1.2.4试纸条的装配用点膜仪在结合垫上喷涂单抗-荧光纳米颗粒偶联物，在硝酸纤维素膜上按照1 μL/cm的量喷涂1.5 mg/mL 黄瓜绿斑驳花叶病毒单抗和1 mg/mL 羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。依次将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫，吸收垫粘贴于PVC衬板上，其中结合垫、吸收垫均与硝酸纤维素膜部分重叠，分别与硝酸纤维素膜重叠约 2 mm，样品垫部分重叠于结合垫上，二者重叠约4 mm；粘贴好后切成4 mm宽的试纸条，将制备好的试纸条置于密封袋中，加干燥剂，密封，4 ℃保存。
1.2.5检测方法取1 g叶片于洁净塑料袋中，加入3 mL PBST（1×PBS，0.5%Tween20，pH值7.4），揉搓塑料袋中的叶片，取汁液进行检测。
往反应杯中加入200 μL提取物，插入试纸条，继续反应5 min，紫外光下肉眼观察结果。
1.2.6试纸条特异性检测采用小西葫芦花叶病毒（ZYMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、烟草花叶病毒（TMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）、南瓜花叶病毒（SqMV）、烟草环斑病毒（TRSV）、甜瓜坏死斑点病毒（MNSV）和黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）作为特异性检测的参照，测试方法同上。
1.2.7稳定性检测将试纸条放在37 ℃下7 d，每天检测阳性样品，观察其稳定性。
1.2.8与胶体金试纸条灵敏性对比试验采用40 nm胶体金参考Frens的方法[6]制备胶体金试纸条。用PBST按8、16、32、64、128倍稀释同一份阳性样本，分别用胶体金和荧光颗粒试纸条进行检测。
2结果与分析
2.1单克隆抗体的效价
间接酶联法测定小鼠腹水抗体效价为1 ∶1 000 000。 2.2抗体的最佳浓度
将单抗梯度稀释后，分别取50、100、150、200、250、300 μg单抗溶液与50 μL的1 mg/mL纳米颗粒偶联，用BCA蛋白检测试剂盒检测偶联后上清中抗体的浓度，取上清中抗体浓度刚好升高的前1个浓度为最佳抗体用量。本试验确定150 μg与50 μL颗粒共价偶联为佳。
2.3荧光纳米颗粒试纸条制备的最佳条件
通过对检测线和质控线包被条件等条件进行优化，最终确定最佳免疫层析体系：随着二抗包被浓度的增加，检测线的亮度也逐渐增加，在达到1.5 mg/mL后亮度不再明显增加，因此确定检测线的最佳包被条件为1.5 mg/mL的二抗。图1为优化后的检测线；随着二抗包被浓度的增加，质控线的亮度也逐渐增加，在达到2.5mg/mL后亮度不再明显增加，因此确定质控线的最佳包被条件为2.5 mg/mL的二抗。图2为优化后的质控线。
2.4特异性
用制备的荧光纳米颗粒试纸条检测黄瓜绿斑驳花叶病毒、小西葫芦花叶病毒等9种植物病毒的阳性样本，除黄瓜绿斑驳花叶病毒外，其余均无交叉反应。典型试验结果如图3所示。
2.5稳定性试验
将试纸条放在37 ℃下7 d，检测不同浓度的阳性样品，观察其稳定性。试验结果证实，试纸条在37 ℃下放置7 d，灵敏性没有明显降低，表明其稳定性较好。
2.6灵敏度对比试验结果
2.6.1胶体金试纸条的制备随着单抗-胶体金偶联物添加量的增加，检测线和质控线的信号越来越强，添加量在0～6 μL之间时，信号强度明显增强，6 μL以上信号强度依然会增强，但是不再明显。考虑到非特异反应等因素，将胶体金的用量定在6 μL。胶体金试纸条典型反应结果如图4所示。
2.6.2灵敏度的对比用PBST倍比稀释同一份阳性样本，分别用胶体金和免疫层析方法进行检测。其中，荧光试纸条用肉眼方式判读，判读结果如表1所示。从表1可以看出，荧光纳米颗粒试纸条的灵敏性高于胶体金试纸条。
表1不同方法灵敏性比较
试纸条类型放大不同倍数后的灵敏性结果4倍8倍16倍32倍64倍胶体金试纸条 ---荧光纳米颗粒试 -纸条（肉眼）注： 表示阳性，-表示阴性。
3结论与讨论
本研究研制的荧光纳米颗粒免疫层析试纸条可以在 10 min 之内得出检测结果，大大快于传统的PCR（1～2 h）、ELISA（1～2 h）等检测方法，提高了检测效率；该方法既适合单份样品的检测，也适合大批量样品的快速检测；该方法对操作者的能力要求不高，操作者只须要经过简单培训就可以独立完成检测工作；该方法不需要大型精密的试验仪器，只需要1台紫外灯就可以了，非常容易开展。与近几年发展较为迅速的胶体金试纸条相比，荧光纳米颗粒中含有多个荧光颗粒，具有良好的发光性能，荧光信号也远远强于传统的标记物质。
黄瓜绿斑驳花叶病毒荧光纳米颗粒检测试纸条的研制成功，为黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测提供了一个极好的检测方法，便于野外检测的开展，为植物保护工作提供了一把利器，也为其他微生物、病毒等快速检测方法的建立打下了坚实的基础。
参考文献：
[1]Hollings M，Komuro Y，Tochihara H.Cucumber green mottle mosaic virus[J]. Descriptions of Plant Virus，1975，154：4.
[2]李红霞，白静，陈红运，等. 南瓜果实中黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-PCR检测及cp基因序列分析[J]. 植物检疫，2007，21（5）：268-270.
[3]尚海丽，周雪平，吴建祥. 免疫斑点法和免疫捕获RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒[J]. 浙江大学学报：农业与生命科学版，2010，36（5）：485-490.
[4]邓丛良，黄峰，吕玉峰，等. 实时荧光RT-PCR方法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒[J]. 植物检疫，2009，23（4）：29-31.
[5]曹洁，杨翠云，潘卫，等. 番茄环斑病毒单克隆抗体的制备[J]. 微生物学杂志，2007（3）：35-37.
[6]Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J]. Nature Physical Science，1973，241：20-22.
关键词：黄瓜绿斑驳花叶病毒；荧光纳米颗粒；试纸条；免疫层析
中图分类号： S436.421.1 9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0152-02
黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是葫芦科作物上重要的植物检疫性病毒，主要分布在欧洲、印度和日本等，严重威胁着西瓜、甜瓜、黄瓜等葫芦科作物的生产，一般减产约15%[1]。2005年辽宁省盖州市西瓜感染了黄瓜绿斑驳花叶病毒，损失惨重，此后在广西、辽宁、河北、山东、广东和北京等地陆续发现疫情，已严重威胁西瓜、甜瓜、黄瓜等作物的生产，因此加强该病毒的检测极为重要。快速检测技术是有效防止黄瓜绿斑驳花叶病毒疫情扩散的重要保障，而现有检测该病毒的方法多为酶联免疫吸附（ELISA）法，该方法可在短时间内检测大量样品，但对检测环境、人员素质及设备等条件要求较高，且血清价格昂贵，不能满足现场快速检测的需要。此外，人们先后研究出多种快速诊断方法，如聚合酶链式反应RT-PCR[2]、免疫捕获RT-PCR（IC-PT-PCR）[3]、实时荧光RT-PCR[4]等，但这些分子生物学检测方法均具有费用昂贵、操作繁琐的缺点，不能满足一线检测人员或田间检测的需求。因此，本研究以黄瓜绿斑驳花叶病毒为检测对象，应用黄瓜绿斑驳花叶病毒的特异性抗体，以稀土荧光纳米颗粒为标记物，制备黄瓜绿斑驳花叶病毒免疫层析试纸条，建立快速、灵敏、准确检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的荧光免疫技术体系。
1材料与方法
1.1材料
牛血清白蛋白（BSA）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；羊抗鼠IgG购自中晶生物技术有限公司；硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜购自美国Millipore公司，所用试剂均为分析纯。荧光纳米颗粒购自深圳易瑞生物技术有限公司。
1.2方法
1.2.1黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的制备参照曹洁等的方法[5]。
1.2.2单克隆抗体的纯化将腹水20 000 g离心 30 min，取上清，往所得上清中逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，室温搅拌30 min，将液体置于4 ℃冰箱中静置过夜；4 ℃，10 000 g离心30 min，弃上清，用pH值为7.4的PBS重悬沉淀，将所得溶液用Protein A柱进行纯化，用PBS（pH值为7.4）滤洗所得产物3次，往透析后的产物中加入海藻糖，使海藻糖的终浓度为5%，100 μL/支分装待用。
1.2.3抗体与颗粒共价偶联取荧光颗粒50 μL，用 50 mmol/L MES（pH值为6.0）洗涤颗粒2次，每次1 mL；用600 μL 50 mmol/L MES（pH值为6.0）重悬颗粒；加入100 mg/mL sulfo-NHS和EDC各200 μL，室温摇动30 min；离心，弃上清；用1 mL 50 mmol/L MES（pH值6.0）洗涤颗粒1次；用1 mL 50 mmol/L MES（pH值6.0）重悬颗粒；加入适量纯化后的黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体，室温振摇1 h；加入等体积的PBS-BSA（BSA含量2%，pH值7.4），继续反应1 h；离心，弃上清；用50 mmol/L MES（pH值6.0）洗涤颗粒3次，1 mL/次；用300 μL重悬液[10 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）、10%蔗糖]重悬颗粒，4 ℃保存，备用。
将单抗梯度稀释后，分别取50、100、150、200、250、300 μg单抗溶液，按上述方法与荧光纳米颗粒偶联，用BCA蛋白检测试剂盒检测偶联后的上清中抗体的浓度并筛选出最佳抗体浓度。
1.2.4试纸条的装配用点膜仪在结合垫上喷涂单抗-荧光纳米颗粒偶联物，在硝酸纤维素膜上按照1 μL/cm的量喷涂1.5 mg/mL 黄瓜绿斑驳花叶病毒单抗和1 mg/mL 羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。依次将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫，吸收垫粘贴于PVC衬板上，其中结合垫、吸收垫均与硝酸纤维素膜部分重叠，分别与硝酸纤维素膜重叠约 2 mm，样品垫部分重叠于结合垫上，二者重叠约4 mm；粘贴好后切成4 mm宽的试纸条，将制备好的试纸条置于密封袋中，加干燥剂，密封，4 ℃保存。
1.2.5检测方法取1 g叶片于洁净塑料袋中，加入3 mL PBST（1×PBS，0.5%Tween20，pH值7.4），揉搓塑料袋中的叶片，取汁液进行检测。
往反应杯中加入200 μL提取物，插入试纸条，继续反应5 min，紫外光下肉眼观察结果。
1.2.6试纸条特异性检测采用小西葫芦花叶病毒（ZYMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、烟草花叶病毒（TMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）、南瓜花叶病毒（SqMV）、烟草环斑病毒（TRSV）、甜瓜坏死斑点病毒（MNSV）和黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）作为特异性检测的参照，测试方法同上。
1.2.7稳定性检测将试纸条放在37 ℃下7 d，每天检测阳性样品，观察其稳定性。
1.2.8与胶体金试纸条灵敏性对比试验采用40 nm胶体金参考Frens的方法[6]制备胶体金试纸条。用PBST按8、16、32、64、128倍稀释同一份阳性样本，分别用胶体金和荧光颗粒试纸条进行检测。
2结果与分析
2.1单克隆抗体的效价
间接酶联法测定小鼠腹水抗体效价为1 ∶1 000 000。 2.2抗体的最佳浓度
将单抗梯度稀释后，分别取50、100、150、200、250、300 μg单抗溶液与50 μL的1 mg/mL纳米颗粒偶联，用BCA蛋白检测试剂盒检测偶联后上清中抗体的浓度，取上清中抗体浓度刚好升高的前1个浓度为最佳抗体用量。本试验确定150 μg与50 μL颗粒共价偶联为佳。
2.3荧光纳米颗粒试纸条制备的最佳条件
通过对检测线和质控线包被条件等条件进行优化，最终确定最佳免疫层析体系：随着二抗包被浓度的增加，检测线的亮度也逐渐增加，在达到1.5 mg/mL后亮度不再明显增加，因此确定检测线的最佳包被条件为1.5 mg/mL的二抗。图1为优化后的检测线；随着二抗包被浓度的增加，质控线的亮度也逐渐增加，在达到2.5mg/mL后亮度不再明显增加，因此确定质控线的最佳包被条件为2.5 mg/mL的二抗。图2为优化后的质控线。
2.4特异性
用制备的荧光纳米颗粒试纸条检测黄瓜绿斑驳花叶病毒、小西葫芦花叶病毒等9种植物病毒的阳性样本，除黄瓜绿斑驳花叶病毒外，其余均无交叉反应。典型试验结果如图3所示。
2.5稳定性试验
将试纸条放在37 ℃下7 d，检测不同浓度的阳性样品，观察其稳定性。试验结果证实，试纸条在37 ℃下放置7 d，灵敏性没有明显降低，表明其稳定性较好。
2.6灵敏度对比试验结果
2.6.1胶体金试纸条的制备随着单抗-胶体金偶联物添加量的增加，检测线和质控线的信号越来越强，添加量在0～6 μL之间时，信号强度明显增强，6 μL以上信号强度依然会增强，但是不再明显。考虑到非特异反应等因素，将胶体金的用量定在6 μL。胶体金试纸条典型反应结果如图4所示。
2.6.2灵敏度的对比用PBST倍比稀释同一份阳性样本，分别用胶体金和免疫层析方法进行检测。其中，荧光试纸条用肉眼方式判读，判读结果如表1所示。从表1可以看出，荧光纳米颗粒试纸条的灵敏性高于胶体金试纸条。
表1不同方法灵敏性比较
试纸条类型放大不同倍数后的灵敏性结果4倍8倍16倍32倍64倍胶体金试纸条 ---荧光纳米颗粒试 -纸条（肉眼）注： 表示阳性，-表示阴性。
3结论与讨论
本研究研制的荧光纳米颗粒免疫层析试纸条可以在 10 min 之内得出检测结果，大大快于传统的PCR（1～2 h）、ELISA（1～2 h）等检测方法，提高了检测效率；该方法既适合单份样品的检测，也适合大批量样品的快速检测；该方法对操作者的能力要求不高，操作者只须要经过简单培训就可以独立完成检测工作；该方法不需要大型精密的试验仪器，只需要1台紫外灯就可以了，非常容易开展。与近几年发展较为迅速的胶体金试纸条相比，荧光纳米颗粒中含有多个荧光颗粒，具有良好的发光性能，荧光信号也远远强于传统的标记物质。
黄瓜绿斑驳花叶病毒荧光纳米颗粒检测试纸条的研制成功，为黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测提供了一个极好的检测方法，便于野外检测的开展，为植物保护工作提供了一把利器，也为其他微生物、病毒等快速检测方法的建立打下了坚实的基础。
参考文献：
[1]Hollings M，Komuro Y，Tochihara H.Cucumber green mottle mosaic virus[J]. Descriptions of Plant Virus，1975，154：4.
[2]李红霞，白静，陈红运，等. 南瓜果实中黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-PCR检测及cp基因序列分析[J]. 植物检疫，2007，21（5）：268-270.
[3]尚海丽，周雪平，吴建祥. 免疫斑点法和免疫捕获RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒[J]. 浙江大学学报：农业与生命科学版，2010，36（5）：485-490.
[4]邓丛良，黄峰，吕玉峰，等. 实时荧光RT-PCR方法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒[J]. 植物检疫，2009，23（4）：29-31.
[5]曹洁，杨翠云，潘卫，等. 番茄环斑病毒单克隆抗体的制备[J]. 微生物学杂志，2007（3）：35-37.
[6]Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J]. Nature Physical Science，1973，241：20-22.