目的：新孢子虫病（Neosporosis）是由犬新孢子虫（Neospora caninum）寄生在宿主体内所引起的一种多种动物共患的血液原虫病。该病不仅对狗等动物造成危害，对牛的危害尤为严重，现已确证，它是世界上许多地区造成奶牛流产、产弱胎、死胎和木乃伊胎的主要原因之一。目前，还没有能够预防治疗新孢子虫病的有效药物和疫苗，故对该病的早期检测是有效防控该病的重要手段。　　方法：本研究根据GenBank上发表的牛新孢子虫NcSAG1基因、Nc5基因、NcSRS2基因和牛性腺（prolactin）基因设计四对特异性引物，以NcSAG1基因、Nc5基因和NcSRS2基因作为目的基因对牛新孢子虫进行检测，以牛性腺基因扩增的片段作为内标对反应过程进行监测，建立了含内标监控物的新孢子虫病多重PCR检测方法；根据GenBank上发表的牛新孢子虫Nc5基因序列和弓形虫GRA6基因序列，设计合成两对特异性引物和两条荧光探针，建立了同时检测新孢子虫病和弓形虫病的双重荧光定量PCR检测方法；根据新孢子虫NcSAG1基因、Nc5基因、NcSRS2基因、牛性腺基因和弓形虫GRA6基因，设计合成相应的五对特异性引物和五条芯片寡核苷酸探针，将各自的标有荧光染料的PCR产物变性后与芯片上的寡核苷酸探针杂交，建立了以牛性腺基因为内标、弓形虫GRA6基因为对照的新孢子虫病多基因芯片检测方法。　　结果：本研究成功地建立了新孢子虫病的三种分子生物学检测方法。　　结论：试验表明，这三种方法均具有良好的特异性、敏感性和重复性，且三种方法都涉及到多个基因，使结果更为准确和全面，可根据检验检疫的实际需要，选择相应的检测方法，为该病的高效、准确、快速检测提供了较好的技术支持。