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紫杉烷是具有五甲基十五碳烯骨架的一类二萜类化合物的总称,其中有些紫杉烷可作为半合成紫杉醇的前体物质。紫杉醇是具有较强抗癌活性的紫杉烷类二萜化合物,主要存在于资源有限、生长缓慢的红豆杉属(Taxus)植物的树皮中,而且含量很低,因而造成了紫杉醇的价格十分昂贵。半合成是解决紫杉醇资源紧张的重要手段之一,巴卡亭Ⅲ和10-DAB是紫杉醇的重要半合成前体。
微生物转化是利用微生物代谢过程中产生的酶对外源物质进行结构修饰和改造的催化反应。与化学催化剂相比,微生物转化具备选择性高、条件温和、相对成本低、副产物少、不污染环境等优势。利用微生物转化对天然产物进行结构修饰,可得到结构新颖、疗效更强的先导化合物,或得到有应用价值的中间体。
酯水解反应属于微生物转化的反应类型之一。本研究筛选得到了紫杉醇的重要半合成前体巴卡亭Ⅲ的C-10位脱乙酰酶产生菌。初步探讨了巴卡亭ⅢC-10位酶法脱乙酰基的反应条件和酶学性质,为利用微生物酶转化半合成生产紫杉烷类活性药物奠定了一定的基础。
如上所述,本论文采用自行设计的培养基和实验方法,以巴卡亭Ⅲ为底物,结合薄层层析、高效液相色谱、液-质联用等检测手段,筛选得到4株巴卡亭ⅢC-10脱乙酰酶产生菌,分别为4.1334、Z1-56、Z1-34和IZ2-1。这4个菌株可以选择性地将巴卡亭Ⅲ的C-10位乙酰基脱去,得到10-DAB,10-DAB是合成多烯紫杉醇和紫杉醇的重要原料。
通过形态特征、生理生化特征、16Sr DNA序列分析等手段,将Z1-56、Z1-34、Z2-1分别鉴定为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、稻草假单胞菌(Pseudomonasstraminea)、烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)。4.1334己知为白色类诺卡氏菌(Nocardioidesalbus)。
以白色类诺卡氏菌4.1 334为实验菌株,对其发酵培养条件、酶促反应条件等进行初步优化。得出菌株4.1334采用液体培养基A时最佳发酵培养时间为8天,酶转化反应产物得率在转化时间为96h时达到最大值9%,底物最优有机溶剂比例在10-20%之间。
对菌株4.1334所产的巴卡亭ⅢC-10脱乙酰酶的酶学性质进行研究。该酶为可溶性胞内酶,以巴卡亭Ⅲ为底物时,最适反应温度为37℃,最适pH为7.0,Km值为1.52mmol/L,Vmax为2.59x10-7mmol/L.S。此酶在温度50℃以下和pH7.0~pH9.0的弱碱性条件下表现出较好的稳定性,有机溶剂耐受上限大于40%,并在碱性条件下体现出较高的活力。Na+、K+、Ca2+、Mg2+是酶的激活剂,Cu2+和CO2+是酶的抑制剂,Fe2+在低浓度时(10-3mol/L)是酶的激活剂,在高浓度时(10-2mol/L)却表现出对酶的抑制作用。用该酶对10-DAB进行了C-10位乙酰化尝试。但在本实验采用的条件下,此酶并不能逆向地对10-DAB进行C-10位乙酰化。