猪链球菌2型在猪脑内及热和氧应激条件下表达上调基因的筛选与功能研究

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猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)是一种重要的人畜共患病原菌,可引起人的中毒性休克综合症和死亡,引起猪的脑膜炎、心内膜炎、败血症、关节炎、浆膜炎和肺炎,是猪的一种重要细菌性传染病,给养猪业造成重大的经济损失。荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外蛋白因子(EF)、溶血素和黏附素等是SS2的重要的毒力因子,但这些毒力因子并不能完全解释SS2的致病机理。广义的毒力因子应该包括那些与体内外环境应答有关的所有因子。所谓的环境应答即病原菌在感染过程中受到温度、渗透压、氧、pH及营养物质利用率等条件影响时所产生的变化。这些感染相关因子的鉴定与表达调控的研究,不仅有利于病原菌致病机理的解析,而且对疫苗、药物和诊断技术的设计与研制具有重要的指导意义。本研究运用转录序列选择性捕获(selective capture oftranscribed sequences,SCOTS)技术鉴定出SS2在高温、厌氧和感染猪脑组织中上调表达的基因,并对其中几种SS2细胞壁蛋白的免疫原性进行了研究,现将主要研究结果报告如下:1.猪链球菌2型在感染猪脑组织中上调表达基因的鉴定以1.5×105 CFUSS2 SC-19株鼻内接种5头健康仔猪,72h后采集感染猪的脑组织,提取总RNA,同时提取体外培养的SS2的总RNA,运用SCOTS技术进行六轮筛选,获得SS2在感染猪脑组织中的上调表达的基因71个。DNA序列分析结果表明,这些包括如下6类:与新陈代谢有关的有30个基因;与细胞壁有关的有12个基因;与复制有关的有9个基因;与蛋白有关的有3个基因;与转录有关的有9个基因;另外有8个功能尚不清楚。2.热应激和厌氧对猪链球菌2型的基因表达调控热应激与厌氧是两种很重要的环境信号,对病原菌的基因表达发挥重要的调控作用。本实验中,以常规体外培养条件为对照,用SCOTS技术筛选出SS2在高温条件下上调表达的基因33个、在厌氧条件下上调表达的基因21个,为SS2在应激条件下的基因表达调控的深入研究奠定了基础。3.体内诱导的猪链球菌2型胞壁蛋白的免疫原性研究从感染猪脑组织中筛选出的71个上调表达的基因中筛选出4个编码细胞壁相关蛋白的基因,进行了克隆表达和蛋白质纯化。将纯化的重组蛋白与氢氧化铝佐剂混合后免疫小鼠2次后,分别用2×LD50和5×LD50的SS2强毒株攻击。试验结果表明,4种重组蛋白均能诱导小鼠产生高滴度的抗体;在使用2×LD50的攻毒剂量时,4种重组蛋白免疫的小鼠都可以保护,但在使用5×LD50的攻毒剂量时,只有Hp0254和Hp1311N具有较好的保护力,可作为候选疫苗抗原。
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