背景：肾癌为我国第二位泌尿系肿瘤，大约占成年人恶性肿瘤的2％-3％。肾癌早期多无临床症状，近一半的肾癌患者首次就诊时即已属晚期。肾癌对放疗、化疗及激素治疗均不敏感，预后不良。随着肿瘤细胞学的迅猛发展，生物反应调节剂，尤其白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-α等的广泛使用使肾癌的预后有了改观。　　 IL-12是由40kD和35kD两个亚基组成的异二聚体，主要由B淋巴细胞、巨噬细胞及树突状细胞等活化的抗原提呈细胞产生的糖蛋白类细胞因子。作为T细胞的生长因子，IL-12能促进Th1介导的CD4+细胞的分化与增殖，控制细胞免疫调节反应；促进T淋巴细胞、NK细胞的发育与增殖，并刺激这些细胞产生IFN-γ；促进NK细胞和细胞毒淋巴细胞的活化；以及抗新生血管形成等多种生物学效应。大量实验已证实IL-12可以对抗肿瘤的生长和转移，然而其抗肿瘤活性需要在较大剂量水平上才能发挥，且往往伴随严重的毒副作用，常引起机体的骨髓造血功能的抑制、肝毒性、脾肿大、肺水肿甚至死亡等副作用，难以在临床上推广应用。若能寻求一种将IL-12基因局限于肿瘤所在部位表达并激发其免疫生物学活性，剂量低毒副作用少而疗效高又持久的途径，无疑会给肾癌治疗带来希望。　　 间充质干细胞(Mesenchyinal Stem Cells，MSCs)是主要存在于成年人骨髓中的一种具有多向分化潜能和很强增殖能力的成体干细胞，在组织损伤修复和器官功能重建等领域已有广泛的研究和应用。近年学者证实注射入循环系统中的骨髓前体细胞能够优先地迁移聚集到肿瘤微环境中。骨髓间充质干细胞向肿瘤趋向迁移的机制目前不是十分清楚，可能的机制：(1)MSCs具有多向分化的潜能，可分化成各种基质成分，当机体的局部稳态平衡打破时(如肿瘤、损伤等)，使局部的组织细胞更新修复加快，从而需要更多的前体细胞迁移到局部参与组织修复。(2)肿瘤微环境中的趋化因子、细胞因子诱导MSCs向肿瘤细胞微环境趋向和迁移。MSCs表达趋化因子受体CXCR4、CX3CR1、CXCR6、CCR1、CCR7等，可分别与相应的趋化因子CXCL12、CX3CL1、CXCL16、CCL3、CCL19等发生反应而诱导MSCs的趋向与迁移。目前认为调控MSCs趋向迁移最重要的趋化因子是基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，CXCL12或SDF-1)。　　 近来人们已逐渐地认识到MSCs拥有许多独特的生物学特征包括：低表达或不表达MHC和共刺激分子，免疫原性弱，同种异体或异种移植几乎不被排斥；繁盛的自我更新与分化潜能；以及有病灶定向迁移，如经静脉输注的MSCs能特异性地聚集于新生组织，如伤口和肿瘤等，从而逐渐显露其具有作为抗肿瘤基因治疗载体的优越性。因此，MSCs以其自身的特点和优势已成为基因疗法中的合适的细胞载体。　　 总之，作为一种新颖的治疗策略，利用MSCs的生物学特性，通过导入目的基因，将细胞工程与基因治疗完美结合，MSCs负载的基因使活性生物分子具有靶向性，能于肿瘤局部有效地表达并抑制肿瘤生成，不伴有明显的副作用，毒性或排斥反应，达到高效能又低毒性的防治肿瘤目标，为肾癌的治疗提供了新的理论基础和新的思路。　　 目的：　　 1.hMSCs的分离、纯化、培养、鉴定及生物学特性研究。　　 2.构建高效分泌IL-12的双亚基共表达质粒pcDNA3.1(+)/rhIL-12。　　 3.利用脂质体法将质粒pcDNA3.1(+)/rhIL-12转染至hMSCs，构建hMSCs-IL-12，并在培养液中获得高效、稳定的表达IL-12。　　 4.体内、外实验检测hMSCs-IL-12对肾癌的抗肿瘤治疗作用，初步探讨hMSCs-IL-12的抗肾肿瘤机制，为hMSCs-IL-12应用于肾肿瘤的治疗提供实验依据。　　 内容：　　 1.hMSCs的分离、纯化、培养、鉴定及体内标记实验：健康志愿者骨髓穿刺获取骨髓液，联合应用密度梯度离心法及贴壁筛选法，来分离、纯化hMSCs。绘制hMSCs的生长曲线，流式细胞仪进行hMSCs鉴定，hMSCs诱导成骨、成脂肪、成软骨等多向分化特性观察。裸鼠皮下注射hMSCs检测成瘤性。用DAPI体外标记hMSCs，将DAPI-hMSCs悬液注射荷瘤鼠体内，注射结束后的10天取肿瘤部位组织、肝脏、肺脏、脾脏等脏器组织，分别做冰冻切片和石蜡切片，荧光显微镜观察DAPI阳性细胞(DAPI-hMSCs)在肿瘤和各脏器组织中的分布。　　 2.双亚基共表达质粒pcDNA3.1(+)/rhIL-12的构建与鉴定：含hIL-12 p35和p40亚单位编码序列的质粒为模板，进行常规PCR。以其为模板进行over-lap PCR，获得rhIL-12融合基因片段。插入pGEM-T中间载体，KpnⅠ和XhoⅠ酶切后插入pcDNA3.1(+)表达质粒，构建双亚基共表达质粒pcDNA3.1(+)/rhIL-12，并提取和纯化，对其挑选克隆扩增、酶切、测序鉴定。　　 3.hMSCs-IL-12的构建、鉴定：利用脂质体法将质粒pcDNA3.1(+)/rhIL-12转染至hMSCs，构建hMSCs-IL-12，大量制备。ELISA法检测hMSCs-IL-12分泌的细胞因子IL-12的含量，Western blot分别检测hMSCs-IL-12中的目的基因的表达水平。　　 4.hMSCs-IL-12抗肾肿瘤作用的研究：MTT法检测hMSCs-IL-12体外对肾癌786-0细胞的杀伤效能。体内抑瘤实验，建立肾癌裸鼠模型，鼠尾静脉注射hMSCs-IL-12、IL-12、hMSCs、PBS，1周2次，连续6周，观察hMSCs-IL-12对荷瘤鼠的治疗作用。测量治疗后肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线并记录荷瘤鼠生存时间；TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率。统计比较hMSCs-IL-12、IL-12、hMSCs、PBS各治疗组之间的差别。　　 结果：　　 1.本实验培养的hMSCs形态均为长梭形或多角形细胞形态，在体外连续传代培养至15代，仍保持其生物学特性稳定。各代hMSCs均高表达CD44、CD73、CD105，不表达CD14，CD19，CD34，CD45，HLA-DR。在体外定向诱导培养下，hMSCs具有分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞等多向分化潜能。裸鼠腋部皮下种植hMSCs2月未见肿瘤形成，各代hMSCs细胞培养上清细菌、衣原体、支原体、真菌检查均阴性。DAPI体内标记证实hMSCs在肿瘤处富集。荧光镜下，组织中肿瘤周边和中央均可见蓝色荧光的hMSCs，主要分布在肿瘤血管周围，肝脏、肺脏、脾脏等脏器均未见蓝色荧光的hMSCs细胞。　　 2.获得了hIL-12 P40和P35双亚基真核表达质粒pcDNA3.1(+)/rhIL-12。采用酶切、PCR扩增及DNA测序对真核表达载pcDNA3.1(+)/rhIL-12进行鉴定，结果显示真核表达载体的构建完全正确。　　 3.将pcDNA3.1(+)/rhIL-12质粒成功地转染hMSCs中并表达hIL-12蛋白质。Western blot分析结果显示在相对分子质量为70KD处呈现一棕色条带，表明为rhIL-12特异性蛋白条带。ELISA检测结果示IL-12基因转染的hMSCs培养上清液中IL-12的水平显著增加，并在转染后第8天达到顶峰，其高峰期是初始值的6倍，而在没转染的hMSCs培养上清液中没检测到IL-12表达。　　 4.MTT检测hMSCs-IL-12对肾癌786-0细胞发挥强烈的杀伤作用，且杀伤率随效靶比的升高而增强，hMSCs对肾癌786-0细胞在高效靶比时有轻度杀伤作用，两组各效靶比之间比较有显著性差异(P<0.01)。体内抑瘤实验，hMSCs-IL-12组、IL-12组细胞移植瘤的生长速度明显慢于对照组，肿瘤标本的体积、重量均小于对照组，hMSCs组肿瘤标本与对照PBS组相比差别不明显。hMSCs-IL-12组、IL-12组存活期较对照组均延长，但IL-12组存活数少于hMSCs-IL-12组。TUNEL法检测各组3周、6周细胞凋亡结果显示：PBS组阳性染色率为(2.85±0.34)％和(3.78±0.57)％；hMSCs组(3.15±0.41)％和(3.96±0.47)％；IL-12组分别为(14.35±0.24)％和(19.68±0.32)％：hMSCs-IL-12组(17.65±0.39)％和(25.58±0.59)％。hMSCs组略高于PBS组，无统计学差异(P>0.05)。hMSCs-IL-12组最高，于PBS组相比有统计学意义(P<0.05)。　　 结论：　　 1.成功分离了hMSCs，扩增培养后的hMSCs仍保持其生物学特性和多向分化潜能。无成瘤性和病原体污染，可作为细胞治疗和组织工程研究的良好的靶细胞，应用于动物模型进行体内研究。　　 2.正确构建了双亚基共表达真核载体pcDNA3.1(+)/rhIL-12。将pcDNA3.1(-)/rhIL-12质粒成功地转入hMSCs中，并在培养中获得长期、稳定、高效表达IL-12。　　 3.DAPI标记的hMSCs证实hMSCs能在肿瘤处富集，具有向肾癌微环境趋向和转移的特性，hMSCs负载的IL-12具有靶向性，能于肿瘤局部有效地表达并抑制肿瘤生成，不伴有明显的副作用或排斥反应，达到高效能又低毒性的防治肿瘤目标。　　 4.hMSCs-IL-12能抑制肾肿瘤生长，延长荷瘤动物的生存期，部分动物长期存活，为肾癌的治疗提供了新的理论基础和新的思路。