谷氨酸脱羧酶(GAD，EC 4.1.1.15)是催化谷氨酸脱羧形成抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的关键限速酶，包括GAD65和GAD67两种形式同工酶，在医学、食品工程等方面都有重要的应用。其中GAD65是胰岛素依赖症糖尿病人(1型糖尿病)血清中自抗体的靶抗原。在1型糖尿病病人的血清中可以检测出多种针对胰岛B细胞的自身抗体，如胰岛细胞抗体(ICA)，胰岛素抗体(IAA)，GAD抗体(GAAS)，羧肽酶H抗体等，查明自身免疫反应的始动靶抗原对明确发病机制至关重要，GAD抗体早在1型糖尿病人症状出现10年前就出现，对提前诊断极有帮助，因而纯化的GAD65蛋白质最有潜力成为早期糖尿病诊断的工具，同时，采用纯化的GAD65可以预防胰岛炎和1型糖尿病的发病。而GAD67溶于胞浆，是一种胞浆酶，GAD67与辅酶PLP的亲和力低，呈高饱和结合；主要以活性的酶型式(holoGAD)存在，在胞浆内新陈代谢区催化谷氨酸生成抑制性神经递质GABA，医学上常利用GAD67的表达来研究治疗癫痫等神经系统疾病。 由于人源GAD的来源有限，使其作为糖尿病的诊断预测试剂价格相对较高，限制了其在医药方面的应用。本研究利用RT-PCR特异性扩增了人源的GAD65抗原决定簇，得到1.5k的目的片断，构建重组表达质粒pQE30-GAD65,并转入大肠杆菌M15中进行诱导表达，获得了以包涵体形式存在的目的片断以及部分截短的蛋白。包涵体变性复性后与糖尿病人血清反应呈阳性，表明了蛋白表达的初步成功。 另外以活性表达为目的，特异性扩增了GAD67的全序列。利用带有促溶标签Trx·Tag，S·Tag的表达载体pET 32a(+)，提高表达产物可溶性；并将构建好的载体转入带有稀有的密码子AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNAs的宿主菌Rosetta中，以确保蛋白表达的顺利进行。同时探索了谷氨酸脱羧酶活性的测定，并绘制了标准曲线的Y=0.0213X+0.0319(Y代表A630；X代表GABA的量，ug)，R<2>=0.993，线形关系良好。为下一步测定酶活，为GAD67高活性突变体的筛选奠定了基础。