论文部分内容阅读
本实验根据GenBank中注册的鸭β-防御素基因序列设计了一对引物,采用RT-PCR方法从鸭脾脏组织中成功扩增β-防御素2(AvBD-2)基因全长片段,将其克隆到pMD18-T Easy载体中进行测序,得到了鸭AvBD-2序列。结果表明,鸭AvBD-2基因cDNA长度为350bp的片段,包含一个长为195bp的ORF框,编码64个氨基酸。将得到的基因与GenBank中已注册的鸭AvBD-2基因比对,核苷酸相似性为98％～100％,氨基酸相似性为95.4％～98.5％。与哺乳动物(人、猪、牛、羊等)以及其他品系禽类的基因序列相比,核苷酸序列相似性分别为19.0％～33.3％,81.5％～85.1％;氨基酸相似性分别为1.5％～12.3％,72.3％～76.9％。其中与国内品种鸭相似性最高,为100％,与哺乳动物相似性较低。说明鸭AvBD-2基因保守性很高,有很好的特异性。
本实验将鸭AvBD-2成熟肽基因克隆并连接到真核载体pcDNA3.1(+)上,成功构建了pcDN.A3.1(+)-AvBD-2真核表达质粒。另将鸭AvBD-2基因与禽流感H5N1的HA基因串联起来,构建了串联质粒pcDNA3.1(+)-AvBD-2-HA,同时构建了pcDN.A3.1(+)-HA质粒。用去内毒素质粒大量抽提试剂盒获得大量高纯度的无内毒素真核质粒,作为DNA疫苗进行动物免疫试验。试验分为5组,每组10只鸡,包括pcDN.A3.1(+)-AvBD-2-HA组、pcDNA3.1(+)-HA组、pcDNA3.1(+)-AvBD-2组、禽流感灭活苗组、pcDNA3.1(+)空质粒组。于14日龄时进行首免,免疫后第10d进行加强免疫一次。免疫后7d、17d、24d、31d对免疫鸡只进行颈静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法检测血清HA特异性抗体水平及血液IL-4、IL-6和INF-γ变化水平;同时分离淋巴细胞,用MTT法检测淋巴细胞增值反应;并于免疫后17d和31d每组随机剖杀2只鸡,称重后取出法氏囊、胸腺和脾脏,计算免疫器官指数。结果表明:
(1)重组质粒组血清中的特异性抗体及细胞因子IL-4、IL-6、INF-γ水平在免疫后7～24d迅速上升,均显著高于空质粒组,联合免疫组与HA质粒组及混合免疫组之间差异显著;免疫后31d,各组抗体水平及细胞因子水平均有所下降;
(2)接种重组质粒的试验组中鸡只外周血T淋巴细胞的转化率在整个试验阶段均显著高于空质粒组,以注射联合质粒组最高;
(3)接种重组质粒实验组鸡只的法氏囊、胸腺和脾脏免疫器官指数在免疫后17d、31d均显著高于空质粒组,联合质粒组与其他各试验组差异显著,但混合免疫组与灭活苗组差异不显著;
由结果推断出鸭β-防御素可以介导机体的免疫应答反应,并增强机体特异性免疫反应。