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[目的]
观察化学合成siRNA沉默eIF4E表达的可行性,并优化转染条件。检测siRNA对Hela细胞eIF4E基因表达的抑制作用及对靶细胞的增殖、凋亡和细胞周期的影响,探讨eIF4E基因对Hela细胞的生物学意义。
[方法]
化学合成4对针对eIF4E的siRNA序列,用脂质体瞬时转染Hela细胞。RT-PCR检测各转染组mRNA表达量的变化,筛选出沉默效果最好的siRNA。将筛选出的沉默效果最好的siRNA转染Hela细胞,设置空白对照组,分别检测转染24h,48h,72h时eIF4E mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞周期的变化,CCK-8法检测细胞增殖情况,Hoechst33258染色检测细胞核形态学变化,免疫细胞化学法检测细胞eIF4E和VEGF蛋白表达水平的变化。
[结果]
1.4对siRNA(eIF4E siRNA-1、eIF4E siRNA-2、eIF4E siRNA-3、eIF4E siRNA-4)对eIF4E mRNA抑制率分别为19.654％、59.260%、29.883%、48.598%,以siRNA-2作用效果最为明显。
2.同空白对照组相比,siRNA-2转染Hela细胞24h、48h、72h后均可观察到靶基因mRNA和蛋白的表达量降低,对靶基因mRNA的抑制率分别为48.236%、59.093%、65.477%,对靶基因蛋白的抑制率分别为32.750%、78.677%、84.137%。
3.siRNA-2转染Hela细胞72h后G0/G1期比例增加9.639±0.655%,S期细胞比例减少7.28±0.536%(P＜0.01)。
4.流式细胞术和Hoechst33258染色分析siRNA-2转染Hela细胞24h、48h、72h后,均未检测到明显的凋亡。
5.siRNA-2转染Hela细胞后,Hela细胞的增殖活性明显降低,72h抑制率达到最大(32.143±3.031,P＜0.01)。
6.siRNA-2干扰Hela细胞eIF4E基因后,eIF4E和VEGF的阳性强度明显降低,提示二者具有相关性。
[结论]
对Hela细胞的eIF4E基因进行瞬时干扰,能够有效抑制eIF4E的表达,抑制效果具有时间依赖性。eIF4E基因的表达受到抑制后,明显抑制Hela细胞的增殖,改变细胞周期,下调eIF4E和VEGF蛋白的表达,但未明显的诱导出凋亡,提示eIF4E可作为肿瘤防治的靶点。