研究背景和目的：　　本课题拟在链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病大鼠（T1DM）模型和遗传性T2DM模型Zucker肥胖大鼠，首先确定糖尿病心肌缺血/再灌损伤高敏性与内源性ADMA蓄积及其信号通路紊乱的关系；再以内源性ADMA的主要生成酶——蛋白精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）为靶点，采用药物（抑制剂TC-E）或基因（shPRMT1慢病毒）干预，观察对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌损伤的防治作用；此外，还在正常大鼠的离体灌流心脏，观察外源性NOS抑制物N-硝基-L-精氨酸（L-NNA）对心功能的直接损害作用，并与离体心脏停灌/再灌损伤比较；并观察PRMT1抑制剂TC-E预处理对离体心脏停灌/再灌损伤的保护作用，以确定内源性NOS抑制物ADMA蓄积在糖尿病大鼠心肌缺血/再灌损伤高敏性中的重要作用及其因果关系，为阐明糖尿病心肌对缺血/再灌损伤高敏的机制提供新的实验证据，为临床防治糖尿病患者心肌缺血/再灌损伤及其药物研发提供新靶点或新思路。　　实验方法：　　1. T1DM大鼠模型制备及分组：取体重为200±10g的SPF级雄性SD大鼠经适应性喂养1周后随机分为：①正常对照+假手术组（Control+Sham），②正常对照+心肌I/R组（Control+I/R），③糖尿病大鼠+假手术组（T1DM+Sham），④糖尿病大鼠+心肌I/R组（T1DM+I/R）；T1DM大鼠模型制备采用一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ，50mg/kg,溶于0.1 mol/L柠檬酸缓冲液, pH4.5），对照组大鼠腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液；糖尿病造模成功后常规喂养8周。　　2.遗传性T2DM Zucker肥胖大鼠模型与分组：8周龄SPF级Zucker雄性肥胖大鼠和8周龄SPF级Zucker雄性对照大鼠（体重为180±10 g，基因型为fa/+）购自北京维通利华实验动物技术有限公司；经适应性喂养1周后随机分为：①Zucker对照大鼠+假手术组，②Zucker对照大鼠+心肌I/R组，③Zucker糖尿病大鼠+假手术组，④Zucker糖尿病大鼠+心肌I/R组，⑤Zucker糖尿病大鼠+心肌I/R+TC-E组，⑥Zucker糖尿病大鼠+心肌I/R+PRMT1干扰慢病毒组；Zucker对照组和Zucker糖尿病大鼠均给予高脂喂养8周；PRMT1抑制剂TC-E治疗组大鼠在心肌I/R手术前18h一次性腹腔注射给予30mg/kg的TC-E；shPRMT1慢病毒干预组大鼠在开胸行心肌I/R手术前10 min用微量注射器于左心室前壁心肌注射滴度为3*108 TU/ml的PRMT1干扰慢病毒140uL。　　3.大鼠在体心肌I/R损伤手术：大鼠麻醉下仰卧位固定，经喉气管插管连接呼吸机，在心脏搏动处沿肋骨走向切开皮肤钝性分离各层筋膜、肌肉、肋骨，用扩胸器撑开4-5肋骨，钝性剥离心包膜，暴露结扎位置，用5-0号带线缝合针进行冠状动脉左前降支（LAD）结扎；可见LAD支配的局部心肌组织由红色转为苍白，左室心肌搏动减弱；30分钟后松开结扎线再灌注；假手术组只将缝合针穿过心肌相同位置并不结扎，其余操作相同；待心脏搏动稳定后缝合关闭肋骨，恢复胸腔内负压并逐层关胸。　　4.大鼠心功能测定：大鼠饲养结束后，用Vevo2100线性超声探头进行M型超声和多普勒超声检测心率、心输出量、射血分数、短轴缩短率、左室收缩末期内经和左室收缩末期容积等反映心脏收缩功能指标；检测等容舒张时间、二尖瓣E/A峰比值、左室舒张末期内经和左室舒张末期容积等反映心脏舒张功能指标，每个指标测定五个心动周期，取平均值记录结果。　　5.大鼠心梗面积测定：心肌缺血/再灌2h后，在原位置再次结扎冠状动脉左前降支，从左心室缓慢注射1％伊文氏蓝4 ml，待心脏充分染色后分离心脏并迅速放入冰生理盐水冲洗，剪去心耳及血管黏膜，迅冻30 min使心脏成型后，沿心脏长轴从心尖至心底部将心脏切为厚约2 mm薄片，用玻片轻轻压平，将组织切片置于1%TTC溶液中37℃温箱避光孵育15 min；活细胞的脱氢酶可将无色的氧化染料TTC还原为红色，因此，活的心肌组织染色后呈红色而梗死心肌组织则不被染色而呈现苍白。　　实验结果：　　1.糖尿病大鼠模型鉴定：无论是 STZ诱导的T1DM，还是高脂饲养8周的遗传性糖尿病 Zucker肥胖大鼠，其空腹血糖水平均明显高于对照组，糖负荷后各时间点血糖浓度均较对照组显著升高（P＜0.01, Fig.2A），血糖-时间曲线下面积较对照组明显增大（P＜0.01, Fig.2B）；遗传性糖尿病Zucker肥胖大鼠在高脂饲养后体型明显肥胖（Fig.3B）并出现多食、多饮、多尿，提示糖尿病模型成立。2.心脏缺血/再灌损伤：①心功能降低：在缺血/再灌损伤前，与正常对照组相比，无论是T1DM还是T2DM大鼠心脏的等容舒张时间（IVRT）延长而E/A峰比值明显降低（P＜0.05~0.01），提示心脏舒张功能障碍；左心室射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）和心输出量均降低并伴有左心室收缩末期内径及容积增加且（P＜0.05~0.01），反映心脏收缩功能损害；但糖尿病大鼠在缺血/再灌损伤前以舒张功能降低更明显。在心脏缺血再灌1~3天，与对照+I/R组大鼠比较， T1DM和T2DM大鼠心脏收缩功能受损更严重（P＜0.05~0.01），但缺血/再灌糖尿病大鼠心脏舒张功能的损伤均不太明显。在缺血前18h腹腔注射PRMT1抑制剂TC-E治疗可明显改善糖尿病Zucker肥胖大鼠心肌缺血/再灌2~24h所致的心脏收缩功能损伤，而shPRMT1干预则对T2DM大鼠心肌缺血/再灌所致的收缩功能损伤无明显影响。②心肌梗死面积增大：T1DM大鼠在心脏缺血/再灌1天后，心肌梗死面积比对照+I/R组明显增大（Fig.8A）；T2DM在在心脏缺血/再灌2h后，心肌梗死面积也较对照+I/R组显著增加； TC-E预处理明显降低T2DM大鼠心脏缺血/再灌后的心肌梗死面积（Fig.8B）。③心肌坏死指标： T2DM大鼠在心肌缺血/再灌前，血清肌酸激酶与乳酸脱氢酶活性就已较对照组大鼠增加（P＜0.05&P＜0.01, Fig.9 C& D），T1DM大鼠血清酶活性虽有升高趋势但无统计学意义；在心脏缺血再灌注后，无论T1DM还是T2DM，以及对照组大鼠血清肌酸激酶和乳酸脱氢酶的活性均显著升高（P＜0.05~0.01, Fig.9）；PRMT1抑制剂TC-E治疗可明显降低T2DM大鼠在心肌缺血/再灌后血清乳酸脱氢酶活性的升高（P＜0.05, Fig.9D），而shPRMT1干预则不能。　　3. PRMT1/ADMA/NOS/NO通路：在基础状态下，与对照大鼠比较，T1DM和T2DM大鼠心肌组织PRMT1蛋白表达上调而eNOS和nNOS表达则下调，ADMA含量增加而NO含量降低（P＜0.05~0.01, Fig.10A）；缺血再灌损伤进一步使对照组与糖尿病组心肌组织PRMT1表达上调而eNOS和nNOS表达下降，ADMA含量更升高而NO含量更紊乱，但对糖尿病大鼠心肌PRMT1/ADMA/NOS/NO通路的影响更明显；PRMT1抑制剂TC-E治疗可降低糖尿病大鼠缺血再灌后心肌PRMT1表达，上调eNOS和nNOS表达，并增加NO含量（P＜0.05~0.01, Fig.10A）；而shPRMT1干预有降低糖尿病大鼠在缺血再灌后心肌PRMT1表达的趋势，但无统计学意义。此外，通过检测PRMT1甲基化蛋白H4R3表达以反映PRMT1酶活性，结果发现，T2DM心肌PRMT1酶活性明显高于正常对照组，缺血/再灌损伤可显著增加对照组大鼠心肌PRMT1活性（P＜0.01, Fig.10A），却不能进一步升高糖尿病大鼠心肌PRMT1活性；TC-E治疗可阻止缺血/再灌所致糖尿病大鼠心肌PRMT1活性的升高，shPRMT1慢病毒干预对PRMT1活性的影响也可产生与TC-E相似的作用（P＜0.05~0.01, Fig.10A）。　　4.相关性分析：用16.0 SPSS统计软件进行直线相关分析，揭示Zucker大鼠心肌ADMA含量与缺血/再灌24h左心射血分数（r=-0.86,P＜0.001）和短轴缩短率（r=-0.84,P＜0.001）呈负相关；心肌PRMT1表达与缺血/再灌24h左心射血分数（r=-067,P=0.005）、短轴缩短率（r=-0.66,P=0.005）亦呈负相关，提示心肌内源性ADMA蓄积和PRMT1表达上调与T2DM大鼠心肌缺血/再灌损伤加重密切相关。　　5.炎症反应：与正常对照组比较，T1DM和T2DM大鼠心肌炎症因子TNF-α与IL-1β水平升高（P＜0.05~0.01，Fig.12）；在心肌缺血/再灌损伤后，糖尿病大鼠心肌TNF-α与IL-1β水平进一步升高，对照组大鼠心肌TNF-α与IL-1β水平也明显升高；提示糖尿病和缺血/再灌损伤均可诱导心肌产生炎症反应；PRMT1抑制剂TC-E治疗可抑制缺血/再灌诱导T2DM大鼠的心肌炎症反应（BothP＜0.05，Fig.12 B& D）。　　实验结论：　　根据以上实验研究结果，可得出如下实验结论：　　1.糖尿病大鼠心肌缺血再灌损伤高敏性与内源性NOS抑制物ADMA蓄积有关；　　2.外源性NOS抑制物L-NNA可产生与心肌缺血/再灌相似的心功能损害；　　3.PRMT1抑制剂TC-E预处理对T2DM糖尿病大鼠心肌缺血/再灌损伤或NOS抑制物蓄积所致的心功能损害有良好的治疗效果。