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中药方剂是中医辨证论治、理方用药的重要手段之一，其君臣佐使等配伍的独特规律及效用已为长年累月的临床实践所证实。目前，中药及其方剂的活性评价通常采用拆方、单方及直接提取分离化学成分，进行活性评价；但对于某一成分在全方中的地位和作用及其与其他成分的相互作用尚缺少理想的手段。在本研究中，我们针对经典的疏肝解郁方剂四逆散改善迟发型超敏反应的作用，通过成分剔除的方法反向探讨该成分在全方中的作用。我们尝试制备针对芍药苷的免疫亲和柱成功从四逆散中选择性地剔除芍药苷，并系统考察了剔除这一成分对全方改善迟发型超敏反应的影响。
四逆散全方由柴胡、白芍、枳实和甘草组成，此方在临床上被广泛应用于炎症性疾病的治疗。在四味药中，白芍是中医治疗中十分常用的一味药，具有多途径抑制自身免疫反应包括抗炎、镇痛、抗应激和免疫调节等作用。本研究以典型的迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity DTH)模型-2，4，6-三硝基氯苯所致的小鼠接触性皮炎(picryl chloride-induced contact sensitivit)，PCl-CS)为工具，从动物整体作用到细胞和分子水平，从全方作用到单体成分到成分的特异性剔除等多个角度观察和探讨了芍药苷的剔除对于四逆散抑制小鼠接触性皮炎的活性改变，从而了解芍药苷在方中担任的角色。
本研究第一章探讨了四逆散、芍药苷及四逆散剔除芍药苷样品对接触性皮炎影响。研究发现，200 mg/kg的四逆散和20 mg/kg的芍药苷于PCl-CS的诱导相给药，可显著减轻耳肿胀，对炎症部位主要由T细胞和巨噬细胞表达的一些细胞因子和炎症介质亦有不同程度的影响；而芍药苷的剔除削弱了四逆散对耳肿胀的改善作用，同时部分地阻断了四逆散对tumor necrosis factor-α(TNF-α)，interleukin-1β(IL-1β)，Cyclooxygenase-2(COX-2)和inducible nitric oxide synthase(iNOS)mRNA水平的下调作用。
在DTH效应相中，活化的T淋巴细胞是关键作用细胞，我们首先考察了剔除芍药苷的四逆散对T淋巴细胞增殖活化及释放细胞因子的影响。结果发现，只有在高浓度组，芍药苷的剔除也只能轻微削弱四逆散对刀豆蛋白A(Con A)所致的淋巴细胞增殖的抑制作用；但并没有显著减弱四逆散对Con A诱导脾细胞产生interleukin-2(IL-2)的抑制作用；并且芍药苷自身对IL-2的释放也没有显著的抑制作用。CD69是T淋巴细胞活化的早期标记性分子，四逆散处理后，活化T淋巴细胞表面高表达的CD69被下调，芍药苷的剔除能够阻碍四逆散的这种下调作用，而芍药苷单体却没有直接抑制作用。T细胞发挥功能时，细胞因子的激活和聚集是DTH发展的关键性步骤。研究还发现，在2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)体外活化PCl体内致敏的小鼠后，无论是四逆散全方，芍药苷单体，还是剔除芍药苷后的四逆散样品均没有显著降低淋巴结细胞产生的Th1型细胞因子TNF-α和IFN-γ的分泌，而只显示出了轻微的趋势。以上结果提示，芍药苷的剔除在淋巴细胞增殖和释放细胞因子的部分指标上并未反应出对四逆散全方作用的显著改变或削弱，亦或芍药苷本身在某些指标上显示了阴性作用。
在DTH的效应相，巨噬细胞被活化的T细胞激活释放IL-1β、TNF-α和NO等并发挥了强大的吞噬和杀伤能力。其中，环加氧酶(COX-2)是催化花生四烯酸转变为前列腺素和血栓素的限速酶，与机体的各种炎症生理病理过程密切相关。接下来，我们着重观察了药物对巨噬细胞功能的影响。结果发现，四逆散全方和芍药苷显著下调脂多糖。LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β和COX-2的mRNA水平，而芍药苷的剔除阻断了四逆散的这种下调作用，并且此结果与小鼠接触性皮炎模型中各给药组耳组织所表达的炎症因子趋势相同。在蛋白水平上，芍药苷的剔除削弱了四逆散对LPS刺激巨噬细胞分泌TNF-α的抑制作用；
并且将芍药苷按不同比例回添至剔除样品，这种抑制效果也剂量依赖性的回复到甚至超过四逆散原方的水平。当巨噬细胞被激活后，细胞吞噬功能增强，同时可产生大量的活性氧及NO等活性物质，加重炎症反应。当在四逆散剔除芍药苷样品中按不同比例回添芍药苷单体后，其抑制效果剂量依赖性的增强并回复甚至超过四逆散原方。与TNF-α的结果呈现很好的一致性。同时，芍药苷的剔除还在一定程度上阻碍了四逆散下调巨噬细胞株RAW264.7释放的COX-2酶活性。这就从正反两方面(剔除和回添)说明了在四逆散改善炎症过程中巨噬细胞功能这一环节，芍药苷确实占据了重要地位，是发挥主要作用的一个成分之一。
此外，影响炎症因子的上游信号通路的有丝分裂原激活蛋白酶(MAPkinases)的磷酸化，在细胞活化和细胞因子的产生和调节过程中起关键作用。无论是四逆散还是四逆散剔除芍药苷样品，对活化的巨噬细胞高水平MAPKs磷酸化均有不同程度的下调。其中，四逆散剔除芍药苷后，原方对ERK1/2 MAPK磷酸化的下调作用被明显阻断。上述结果表明，芍药苷的选择性剔除却大大削弱了四逆散对于LPS介导的巨噬细胞的活性和功能。很显然，芍药苷在这方面的作用对于四逆散的作用贡献更大。
最后，我们还对T细胞和巨噬细胞在炎症部位都会分泌的巨噬细胞游走抑制因子(MIF)进行了考查。MIF可抑制巨噬细胞的移动，使局部巨噬细胞停留或聚集在炎症发生部位，诱导其分泌TNF-α和IL-1β等。四逆散和剔除芍药苷的四逆散处理后，对于巨噬细胞MIF的基因水平和蛋白水平较刺激剂对照组均没有显著的增高或降低，相反却可削弱四逆散对脾细胞MIF基因水平和蛋白水平的表达的下调作用。
综上所述，芍药苷是四逆散作用于迟发型超敏反应的活性成分之一，芍药苷在四逆散全方中所发挥的治疗作用的特点在于，下调巨噬细胞的功能和影响T细胞分泌影响巨噬细胞功能的因子MIF，同时也间接的调节T细胞的增殖和CD69的表达。成分的特异性剔除这一崭新研究思维是中药方剂研究中的重要创新和补充，可为方剂研究提供新的途径。