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据统计,近年来世界各国各种疾病的发病率和死亡率统计中,心脑血管疾病占第一位。这类疾病主要是由于血液中积聚过多的胆固醇造成的。因此,如何降低血液中胆固醇的含量成为攻克心血管疾病难题的金钥匙。
人体内只有1/3的总胆固醇来源于食物,其余2/3由肝脏和小肠合成。产自红曲霉的次级代谢产物莫纳可林K(Monacolin K),能有效抑制胆固醇的合成,大大降低机体内胆固醇的含量,从而解决了心血管病患者的困扰。
Monacolin K属于聚酮体化合物,由聚酮体合成酶(PKSs)合成,是PKSs基因家族的产物。国外在一些真菌的PKSs领域进行了卓有成效的基础理论研究,但对红曲霉的PKSs基因报道甚少。
本文对实验室获得的一株高产Motlacolin K的红曲霉突变菌株及其野生株进行了基本的生理生化性质研究。发现该突变株在菌落形态上发生了较大的改变;生长速度较野生株有较大幅度地降低;最适生长温度介于30~33℃之间。能利用实验室常见的17种碳源,但无法对甘油、木糖和果糖等碳源进行发酵产气。有机复合氮源较无机氮源更有利于其生长。
这株红曲霉突变株在产红曲色素的表现上也非常突出。本论文由检测方法,最佳温度、最佳碳源、氮源等角度对这株菌的色素生产进行了研究。确定其发酵液在波长为409nm、501nm处有两个强烈的吸收峰,适用于色价的检测;最佳色素生产温度为30℃;葡萄糖是色素生产的最佳碳源;氮源对色素合成的影响很大,其中硝酸盐对红色素的生产有刺激作用,而铵盐则有利于黄色素的合成。
本论文对以高效液相色谱法检测Monacolin K作了初步的研究,确定本实验室条件下适宜用配比为65:35的乙腈.磷酸水溶液作为流动相;保留时间为11.2 s;以及检测标准曲线和产量曲线的绘制等。
根据PKS基因的cDNA序列将其从红曲霉突变株和野生株的总DNA组中扩增出来,并进行比对,证明此段基因不含内含子,并且突变株在该段基因上没有发生碱基突变。在NCBI网站上进行比对,此序列与黄曲霉毒素醛还原酶有很高的同源性;并对其做了结构域和蛋白三维结构的预测。
设计两条引物In-F和In-B从红曲霉Palosus IFO 4520中扩增出一段PKS基因,纯化后连接至T载体上,得到克隆载体pMD19-Mona。双酶切pMD19-Mona克隆质粒和pGEX-4T-2表达载体质粒,得到目的基因片段和载体片段,连接后转入大肠杆菌BL21(DE3),经筛选和鉴定后确定原核表达载体pGEX-4T-Mona构建成功。本论文对实验室获得的一株高产Monac01in K红曲霉突变菌株进行了较为系统的研究。为此菌株的应用开发,以及为利用生物工程方法构建高产Monacolin K的工程菌奠定基础。