胸腺增龄性退化与萎缩是机体老化过程中最重要的免疫系统表现，可能是决定和制约免疫系统老化的关键环节。然而胸腺萎缩的调控机制至今尚不清楚。晚近的研究表明，胸腺萎缩过程伴随着基因表达的改变，基因表型不同的个体其胸腺萎缩的速度和程度存在明显的差异。因此，我们推测，胸腺萎缩是一个受遗传基因调控的过程，其中基因的变化或基因间相互作用可能共同导致胸腺萎缩。此外，本课题组以往的研究资料表明，氧化应激状态下小鼠胸腺的结构和功能受到明显损害，并出现衰老的迹象，这提示氧化损伤可能参与了胸腺萎缩的过程。 本研究旨在进一步阐明胸腺萎缩的基因调控机制以及寻找延缓胸腺萎缩和改善免疫功能的有效方法。首先，我们利用生物信息学、酵母双杂交和蛋白质相互作用验证等技术，对已获得的胸腺增龄相关新基因IH-1的功能进行了研究，初步明确了IH-1基因所具有的生物学功能，并探讨了其与胸腺内T淋巴细胞分化发育的关系；其次，利用体外抗氧化检测技术和氧化应激模型小鼠，对41种天然植物的抗氧化作用进行体内外筛选，获得了数种具有较强抗氧化和免疫调节功能的植物，最终为延缓胸腺萎缩和免疫老化的控制提供新的思路和手段。 本研究完成的主要工作及其结果如下：一、小鼠胸腺增龄相关新基因IH-1的功能研究1、分析了IH-1基因的结构特点IH-1基因cDNA全长1001bp，含一个732bp的完整开放阅读框(71～802)，编码一个具有243个氨基酸、分子量约为28KD的蛋白质。我们首先利用SMART软件进行结构域搜索，发现在IH-1基因编码产物的第10～114氨基酸处有一个RWD结构域，虽然该结构域的功能未见明确报道，但有分析资料显示RWD结构域可能与细胞内的泛素-蛋白酶体代谢途径有关。对蛋白质翻译后修饰位点的预测结果表明，IH-1基因编码蛋白具有糖基化修饰位点、SUMO序列修饰位点以及多个潜在的磷酸化修饰位点。 2、观察了IH-1基因在胸腺及脾脏中的表达及分布为了确定IH-1基因在不同发育阶段胸腺细胞和成熟T淋巴细胞中的表达水平，我们首先分离胸腺细胞和脾脏细胞，利用流式细胞分选技术获得各发育阶段T淋巴细胞。随后采用RT-PCR方法对IH-1基因的表达情况进行初步分析，结果表明CD4-CD8-双阴性(DN)细胞和CD8+单阳性(SP)细胞中IH-1基因表达水平较高；而IH-1基因在CD4+CD8+双阳性(DP)细胞和CD4+单阳性(SP)细胞中的表达水平较低；成熟T淋巴细胞中也有IH-1基因的表达。 3、利用酵母双杂交技术，筛选到与IH-1基因编码产物相互作用的蛋白分子，并对蛋白质间相互作用进行了验证我们构建了用于酵母双杂交的1月龄小鼠胸腺pGADcDNA文库，并以IH-1基因编码产物全长作为“诱饵”蛋白对文库进行了筛选，结果获得两个在酵母细胞中与IH-1基因编码产物相互作用的蛋白分子：UbB(UbiquitinB)和Nedd8(Neuralprecursorcellexpressed，developmentallydown-regulatedgene8)。结合我们前期的酵母双杂交实验结果，我们初步认为IH-1基因编码蛋白可能与UbB、Nedd8以及RACK1(Receptor1forActivatedC-Kinases)相互作用。 4、初步探讨了IH-1基因编码蛋白与NF-κB活性之间的关系我们采用NF-κB荧光素酶报告基因检测技术，结果发现IH-1基因编码蛋白能够活化NF-κB，并且存在一定的剂量依赖关系。为了寻找该传导通路的细胞外信号，我们用IL-1β进行细胞外刺激，结果表明IL-1β能增强IH-1基因编码蛋白对NF-κB的活化作用，并且也有剂量依赖性。 二、41种天然植物体内外抗氧化作用的研究 1、完成了41种天然植物体外抗氧化作用的研究 采用除羟基实验、超氧阴离子生成抑制实验、大鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆发抑制实验及DNA氧化损伤抑制实验，对41种天然植物的抗氧化作用进行了体外筛选。结果发现多数植物具有不同程度的抗氧化作用，其中有13种植物在体外的抗氧化作用强于或相当于维生素C或维生素E，它们是水溶性植物儿茶素(Catechin)、茶多酚(Cathechin)、绿茶(Greentea)、红茶(Blacktea)、乌龙茶(Oolongtea)、丁香(Clove)、覆盆子(Bilberry)、葡萄籽(Grapeseed)和西伯利亚人参(Siberianginseng)；脂溶性植物银杏(Ginkgo)、树脂(Propolis)、迷迭香(Rosemary)和鼠尾草(Sage)。另外，我们将这些植物进行搭配组合(如丁香+覆盆子)，结果发现组合后的作用效果与单一植物的作用无显著差异。 2、完成了13种天然植物体内抗氧化及免疫调节功能的研究 在体外实验基础上，我们选择出效果良好的13种植物，利用氧化应激小鼠模型研究这些植物在体内的抗氧化及免疫调节功能。结果发现，多数植物具有明显的抗氧化及调节免疫作用，但是与维生素C或维生素E相比，其效果欠佳。结果如下：儿茶素、丁香、银杏、茶多酚、乌龙茶、绿茶和树脂具有较为稳定的抗氧化及改善免疫功能的作用；覆盆子在体内能改善免疫功能，但其抗氧化效果相对较弱；丁香+覆盆子组方也表现出有效的抗氧化和免疫保护作用；红茶、迷迭香和鼠尾草也具有一定的抗氧化作用，但效果均较弱；西伯利亚人参在体内的作用效果较差可能与其增强机体代谢水平有关。 综上，本研究产生以下结论：1)IH-1基因编码蛋白可能作为信号传导分子，在胸腺细胞内与泛素及泛素样蛋白相互作用，通过泛素化代谢过程参与转录因子NF-κB的活化，从而促进胸腺细胞的分化发育。但是，IH-1基因增龄性表达下调的分子机理以及其与胸腺萎缩的关系仍有待进一步研究；2)筛选出数种兼具有抗氧化及改善免疫功能的植物，为抗衰老药品的开发提供了有价值的资料。总之，本研究为阐明胸腺增龄性萎缩的基因调控机制的研究奠定了重要的基础，也为如何延缓胸腺萎缩和控制免疫老化等方面的研究提出新的思路和方法。