研究目的：酪氨酸激酶下游分子(Downstream of tyrosine Kinase，Dok)家族成员是一类存在于胞浆中的与酪氨酸激酶有关的信号转导分子，其中蛋白p62Dok(Dok1)可作为酪氨酸蛋白激酶(PTK)(v-Abl，v-Src，Tec和bcr-abl融合癌蛋白)或受体型PTK／RTK(EGFR、PDGFR、IR、Eph)的直接底物分子而被磷酸化。Dok1结构的N端包括一个pleckstrin的同源域(PH)和一个磷酸化酪氨酸的结合域(PTB)，它们分别被认为是Dok1与细胞膜和包含磷酸化酪氨酸的基序结合的结构域。Dok1还包括许多可被胞浆和RTKs磷酸化的一致的酪氨酸残基序列。如果这些酪氨酸残基发生磷酸化，它们会组成性的招募各种包含Src homology 2(SH2)结构域的信号分子，例如Ras GTP酶激活蛋白(rasGAP)、结合蛋白Nck和胞浆PTK Csk。因此Dok1的结构很像多位点的招募蛋白，例如胰岛素受体底物(IRS)，在PTK下游的细胞事件中起着关键的调节作用，例如IR通过IRS促进细胞的迁移。 已有文献报道Dok1在应答EGF刺激时其酪氨酸残基被磷酸化，细胞中Dok1磷酸化的生理意义目前仍不太清楚。细胞黏附和胰岛素诱导的Dok1的磷酸化与细胞迁移有关，Dok1的磷酸化还可能决定了肿瘤细胞表型的获得，而几乎所有的肿瘤细胞中细胞骨架都有不同程度的改变。表皮生长因子受体(EGFR)激活的细胞中可观察到骨架改变的一种形态：背膜皱褶郑州大学2004年研究生毕业论文Cos一7细胞中Dokl抑制EGF诱导的膜皱褶的形成 (dorsal ruffle)，目前的分子生物学实验研究表明Doks的PTB结构域是其与RTK上磷酸化的酪氨酸残基结合的功能区。本研究欲从细胞学角度进一步搞清是否是PTB结构域介导了Dokl(RTK的底物)的下游信号转导作用，介导了细胞的生物学效应，包括细胞骨架形态的改变，变得有利于细胞的运动，甚至可能促进了细胞的迁移，这样不仅能够从细胞学的角度深入认识生物学效应的分子机制和信号分子Dokl的关键结构域在RTK下游信号转导中的重要作用，而且可为进一步探讨Dokl与某些肿瘤细胞表型获得的关系提供理论提示及实验方法的依据。深入研究其下游的信号转导机制还可为某些肿瘤转移的治疗提供新的思路，具有重要的理论意义及应用前景。 方法:为进一步从细胞学的角度深入认识生物学效应的分子机制，信号分子Dokl的关键结构域在RTK下游信号转导中的重要作用，搞清是否是Dokl通过关键结构域，改变了细胞的形态骨架，以利于细胞的运动，促进了细胞的迁移，及其下游的信号通路。本实验采用重组DNA技术构建了YFP一Dokl，利用缺失突变和点突变的方法构建了YFP一Dokl的突变体(△PH，△PTB，R207A，R222A)。利用细胞转染的方法，将这些质粒在真核细胞中进行表达，利用细胞染色的方法，显示细胞形态骨架的改变。利用通路选择性抑制剂干扰法确定参与的信号通路，利用荧光显微镜显示表达荧光蛋白的细胞，并进行一系列观察、记数和统计分析。 本研究的主要结果如下: 1.通过分析Dokl的结构及表达载体YFP的图谱序列，利用亚克隆的方法成功构建了YFP一Dokl及其突变体(△PH，△PTB，R207A，R222A)的质粒。 2.将构建好的质粒转染到Cos一7细胞中，待其表达后，用荧光显微镜观察发现Dok1WT的定位无特异性，在胞浆和胞膜均有分布，Dokl△PH只分布于胞浆，Dokl△PTB在胞浆、胞膜均有分布。验证了PH结构域与Dokl分子的膜定位有关，同时证明构建的质粒有效。 3.利用荧光显微镜实时观察的方法，将构建好的YFP一Dokl转染到C。S一7细胞中，发现无特异性发布的Dok1WT针对EGF的刺激，有明显的膜上聚集现象，并且利用通路选择性抑制剂干扰法证明了此通路是P工3K途郑州大学2004年研究生毕业论文Cos一7细胞中DOkl抑制EGF诱导的膜皱褶的形成径依赖性的。 4.利用细胞染色的方法显示细胞形态骨架的改变可观察到，转染DoklwT的cos一7细胞明显减少了EGF诱导的膜皱褶的形成，从细胞形态方面首次发现Dokl影响细胞骨架(actin)的重组。 5.表达荧光蛋白的细胞经过染色后利用荧光显微镜可观察actin与Dokl分子的共定位，发现Dokl的各主要结构域中，PH+PTB结构域与actin的共定位最明显。 6.利用缺失突变和点突变的方法进一步发现转染Dokl的Cos一7细胞的骨架改变是通过Dokl的PTB结构域直接介导的，即Dokl是通过PTB结构域抑制了EGF诱导的膜皱褶的形成，PH结构域也可间接影响Dokl发挥作用。 结论:本试验通过将构建的YFP一Dokl及其突变体(△PH，△PTB，R207A，R222A)转染到cos一7细胞中进行表达，首次发现转染Dokl的CoS一7细胞明显减少了EGF诱导的膜皱褶的形成，这种骨架改变是通过Dokl的PTB结构域直接发挥作用的;作为RTK的下游底物，PH结构域首先介导Dokl上膜，然后才能发挥下游的信号转导作用，所以缺失PH结构域也可间接影响Dokl发挥细胞学功能，影响细胞骨架(actin)的重组。