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维生素C生产的主要工艺是“两步发酵法”,属我国独创。随着维生素C的国际市场竞争的加剧,开展技术创新、提高发酵效率、降低生产成本是增强企业核心竞争力的根本,而选育高效维生素C发酵菌系并优化其发酵条件,是提高发酵效率的一个最重要途径。
本文以Vc两步生物发酵法的第一步和第二步生产菌为研究对象,通过神舟七号飞船搭载,进行太空诱变,经选育,获得了若干高效诱变株,并对高效株进行了代谢活性的调控,最终提高了发酵效率并实现了高效菌株的生产应用。主要研究结论如下:
1.对一步菌氧化葡萄糖杆菌进行了太空诱变选育,共挑取945株太空诱变的单菌落,经过多轮筛选,获得3株高效菌,菌编号分别为G454,G391和G802。以G454作为首选菌株,开展实验室小试和工业发酵试验。实验室摇瓶结果显示其发酵周期较生产菌缩短约2h;且可在高浓度山梨醇(30%)条件下发酵,发酵周期约24h;连续5批次工业生产的大罐(180吨)发酵试验,G454的发酵周期缩短约2h(约10%)。
2.对新筛选的一步菌G454在高浓度山梨醇条件下的培养和发酵特征进行了研究,发现在高山梨醇条件下,提高酵母膏和玉米浆浓度及调节pH,均不能有效促进山梨醇转化。通风量和种液质量则是影响G454转化D-山梨醇的重要因素:摇瓶条件下的最适装量为180ml/750ml;35%山梨醇发酵液做种液均优于三级种液,且中期发酵液优于终点发酵液。
3.从G454细胞膜上分离纯化得到一种山梨醇脱氢酶,该酶由两个分子量分别为65kDa和60kDa的亚基组成;它具有广泛的作用底物,但不具备氧化山梨糖的能力;其最适反应温度为37℃,最适pH为5.6;Fe2+、Fe3+和Cu2+均对该酶具有强烈的抑制作用,但低浓度的Co2+可以提高酶活;其米氏常数Km为15.73。
4.优化了G454的补醇发酵条件:接种量15%-30%;补加山梨醇时间为发酵至12-14h且山梨糖浓度达到150-180mg/ml;以20%-30%的补醇体积为宜;提高发酵培养基中玉米浆至0.3%;增加通风量20~30%。
5.建立了两罐互换、分阶段调控的高浓度山梨醇连续发酵新工艺。并对新工艺进行了生产验证。连续5批生产罐发酵,山梨醇终浓度达到33%,发酵29.2h,可顺利完成发酵转化,实现了Vc一步高山梨醇浓度连续发酵新工艺的生产应用。
6.通过测定菌液OD650,以伴生菌进入对数期的早晚和对数期持续长短为判断菌株伴生潜力的依据,建立了一种Vc二步发酵高效伴生菌的快速筛选方法。10h前进入对数期、对数期持续时间约12h的菌株具有高效的促进小菌生长和发酵产古龙酸的潜力。通过该法获得高效伴生菌的概率为71%。该初筛法简便、高效,利于大规模初筛应用。
7.建立了以溴百里酚蓝为指示剂的产酸菌平板快速初筛方法,该方法操作简便,筛选准确度高,同传统随机挑取法相比,获得正突变的几率从35%提高到70%,大大提高了筛选效率。
8.对二步发酵的三个菌系(2980菌系,25b菌系和1514菌系)分别进行了太空诱变选育,共挑取诱变菌株12461株,其中伴生菌(大菌)3131株,产酸菌(小菌)9330株。经过多轮筛选,最终获得高效大菌6株、高效小菌8株。摇瓶发酵结果表明,诱变所得新菌系KB2051-166还具有耐高温(33℃)发酵的特性。该菌系连续十批大罐发酵,发酵周期较生产菌缩短4.2h,转化率提高了3.40%。
9.研究了第二步突变菌系KB2194-320的培养特征及其代谢活性。伴生菌B320在平板上生长快,其菌落特征与其它伴生菌有明显差异。探索了该菌系斜面培养基配方,确定以斜面培养基配方组分含量减至原配方1/5为新配方,它对制种和发酵最有利。优化培养基后,KB2194-320发酵转化率高于生产菌系6.9%(第42h)。在发酵过程中,新菌系在发酵0-16h期间古龙酸积累速度较慢,20-40h为古龙酸快速积累期(大于1.5mg/ml/h),发酵32h时积累速率达到最大值,为2.97mg/ml.h,显著高于生产菌系。连续5代摇瓶发酵,新菌系KB2194-320遗传性状较为稳定,5代平均转化率为92.4%。