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实验背景和目的冠心病(CHD)是心血管疾病中最常见、最重要的一种。它作为危害人类健康的“第一杀手”,已波及全球,成为许多发达国家的主要灾难。冠心病发病实质是心肌缺血,即冠状动脉管腔不同程度的狭窄或阻塞而造成心肌缺血、缺氧,从而发生一系列的临床症状(如胸闷、心绞痛),甚至发生心肌梗死危机生命。因此,保持血管通畅,保证心肌血供是治疗关键。现今冠心病的治疗可分为药物治疗、内科介入治疗和外科搭桥治疗三种,其中介入和药物联合治疗是主要的治疗手段。介入治疗开始应用至今已经有超过30年的历史,技术已较成熟并成为冠心病治疗的主要手段。目前,药物涂层支架(DES)已代替最初的金属裸支架(BMS)占据着介入治疗主要市场。以雷帕霉素(RAPA)涂层支架为例,其植入后通过特别控制支架聚合涂层,在血管内释放雷帕霉素这种抗肿瘤药物,抑制血管内皮及平滑肌细胞增殖迁移,从而达到降低再狭窄率的目的。除此以外,长期的药物治疗是冠心病患者治疗的基础。他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,是治疗冠心病的常规用药。同时,他汀是一类多效型的药物,除了降低血脂作用外,还能促进血管内皮细胞增殖和迁移,诱导一氧化氮(NO)的合成和释放,抑制细胞凋亡和抗炎等作用。本实验以辛伐他汀(SIM)为例,以对心脏物质交换有着重要地位的心肌微血管内皮细胞(CMECs)为研究对象,观察药物支架植入后,辛伐他汀与雷帕霉素共同作用下的心肌微血管内皮细胞的影响。实验方法第一部分:RAPA对CMECs的影响1.酶消化法体外培养大鼠CMECs,取第2-3代细胞进行下一步实验。2.CMECs完全随机分为5组并加入不同浓度的RAPA,分别为对照组、0.01μg/L组、0.1μg/L组、1μg/L组及10μg/L组。干扰时间为24h。3.用MTT法检测CMECs的增殖情况,用transwell法检测CMECs的迁移能力。4.选择合适的RAPA干扰浓度(抑制增殖与迁移能力居中)。第二部分:SIM对RAPA作用下CMECs的影响1.CMECs随机分为4个大组,分别为对照组,SIM组,RAPA组和SIM+RAPA组。其中SIM+RAPA组又分为RAPA(1μg/L)+SIM(0.01μmol/L)组、RAPA(1μg/L)+SIM(0.1μmol/L)组、RAPA(1μg/L)+SIM(1μmol/L)组、RAPA(1μg/L)+SIM(10μmol/L)组。干扰时间为24小时。2.分别用MTT和transwell法检测各组增殖和迁移能力;用Hoechs(t33258)染色检测细胞凋亡情况;用NO分泌活性的Griess反应试剂盒检测NO的合成和分泌。实验结果1.体外成功培养有内皮细胞特征的CMECs。2.RAPA能显著抑制CMECs的增殖与迁移能力,并呈浓度依赖性,即浓度越高,其抑制能力越强。本实验选取1μg/L作为基础浓度,进行下一步实验。3.单独的SIM组(1μmol/L)能促进CMECs的增殖和迁移能力,抑制细胞凋亡,促进NO的合成和分泌。4.将不同浓度的SIM加入RAPA(1μg/L)后,能改善RAPA对细胞增殖和迁移的抑制作用,对增殖和迁移的抑制改善最明显浓度分别出现在1μmol/L和0.1μmol/L。然而,改善最明显浓度均不出现在10μmol/L,SIM在1μg/L及以下的浓度,对RAPA抑制的改善作用呈浓度依赖性,即浓度越高,改善作用越明显;在1μg/L以上的浓度改善作用不显著。5.单独的RAPA使CMECs的凋亡率升高,加入SIM后能抑制其诱导凋亡的作用,抑制最明显的浓度出现在1μg/L。6.RAPA能抑制CMECs的NO合成与分泌,SIM能改善其抑制作用。结论RAPA为一种抗肿瘤药物,能够显著抑制CMECs的增殖和迁移,并呈浓度依赖性。除此以外,它还能诱导CMECs的凋亡,抑制CMECs的NO合成和分泌,对CMECs有一定的损伤作用。SIM(1μmol/L)能促进CMECs的增殖和迁移,抑制凋亡,促进NO的合成和分泌。在RAPA干扰的CMECs中加入不同浓度的SIM共孵育24h,可以改善RAPA的抑制作用,降低凋亡率,从而抑制其对CMECs的损伤作用。