天冬制剂介入抗肝癌作用及机理研究

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目的:  观察天冬多糖及天冬胶肝动脉介入治疗大鼠原位移植肝癌的疗效,为天冬多糖及天冬胶经肝动脉介入治疗肝癌提供理论依据。初步探讨低氧环境下天冬多糖对人肝癌细胞生长的影响及可能作用机制。  方法:  构建大鼠原位移植肝癌模型,将160只大鼠随机分为8组,每组20只。8天后经肝动脉介入给药,分别给予生理盐水、碘化油、低剂量和高剂量丝裂霉素、低剂量和高剂量天冬多糖、低剂量和高剂量天冬胶。观察指标:每隔3天称量给药前后的大鼠体重;给药后第二天起每组取10只大鼠记录生存期;治疗后第8天每组另10只大鼠处死后,1)腹主动脉抽血检测血常规、肝肾功能;2)游标卡尺测量治疗后肿瘤体积;3)病理组织学检测观察肝癌组织病理情况;4)免疫组织化学法检测各组肝癌细胞VEGF、MVD的表达;5)提取肝癌组织总蛋白,采用Western blot方法分别检测各组肿瘤细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleavedcaspase-3的表达。  体外培养四种人肝癌细胞株(HepG2、Hep3B、SMMC-7721及Bel-7402),氯化钴化学模拟低氧环境,四种肝癌细胞均设为6组:常氧对照组,低氧对照组,低氧加天冬多糖低、中、高剂量组,常氧加高剂量天冬多糖组。观察指标:MTT法检测不同浓度的天冬多糖作用四种人肝癌细胞株24h后对细胞增殖的影响;光镜观察细胞形态变化;低氧下不同浓度天冬多糖作用于四种细胞24h后收集细胞上清,提取细胞mRNA及总蛋白,采用Real-time PCR检测各组肝癌细胞VEGF、bax、bcl-2 mRNA表达,Western-blot方法检测各组HIF-1α、VEGF、MPP-9、Cleaved easpase-3蛋白的表达。  结果:  1.天冬多糖及天冬胶对肝移植瘤的治疗作用:①天冬多糖组和天冬胶组的抑瘤率高于生理盐水组,差异具有统计学意义(P<0.05)。②天冬多糖和天冬胶组的大鼠生存期长于其他各组,且天冬胶组大鼠的生存期长于天冬多糖组。③病理学观察到天冬胶组肿瘤组织内坏死程度高于天冬多糖组。  2.天冬多糖和天冬胶对荷肝移植瘤大鼠的毒性作用及逆转作用的研究:①随着四个不同时间点,每组大鼠的体重显著下降(P<0.05),而大鼠体重组间比较无显著差异(P>0.05)。②血常规显示丝裂霉素组的白细胞计数显著低于其他各组(P<0.05),天冬多糖可恢复白细胞计数而提高大鼠的免疫力。③肝肾功能检测结果表明:碘化油组的谷草转氨酶显著高于其他各组(P<0.05),天冬多糖和天冬胶组的尿素氮显著低于其他组(P<0.05),表明天冬多糖及天冬胶保护减轻大鼠的肝肾损伤。  3.天冬多糖和天冬胶治疗肝移植瘤的机制研究:①Western blot结果显示天冬多糖和天冬胶上调Cleaced caspase-3蛋白及下调Bcl-2蛋白的表达,促进肿瘤细胞的凋亡。②免疫组化结果显示与生理盐水组及碘化油组比较,天冬多糖及天冬胶显著抑制VEGF、MVD的表达,差异具有统计学意义(P<0.05),且高剂量天冬胶组表达VEGF、MVD低于其他各组。  4.低氧下天冬多糖对人肝癌细胞的作用结果:低氧下天冬多糖抑制人肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMMC-7721及Bel-7402的生长,且抑制作用随着浓度的增加而增强(P<0.05)。  5.低氧下天冬多糖抑制人肝癌细胞的机制研究:①Western blot结果显示天冬多糖下调HIF-1α、VEGF蛋白表达,及下调MPP-9蛋白水平,促进Cleacedeaspase-3蛋白的表达。②RT-PCR显示天冬多糖抑制VEGF mRNA的转录水平;具有上调人肝癌细胞凋亡基因bax mRNA、及下调bcl-2 mRNA的作用。  结论:  1.天冬多糖及天冬胶不仅具有抑制大鼠肝移植瘤生长、延长大鼠的生存期的作用,而且减轻介入术后的大鼠的肝肾毒性,通过下调Bcl-2、VEGF、MVD及上调Cleaced caspase-3蛋白水平而起到抗肝癌作用;同时研究显示天冬多糖制成天冬胶制剂,作用强于天冬多糖,提高了介入治疗肝癌的疗效,为天冬胶作为新型的栓塞剂提供了理论基础。  2.天冬多糖在体外低氧条件下能抑制肝癌细胞的生长,通过抑制HIF-1α/VEGF通路、抑制肝癌细胞的侵袭、促进肝癌细胞凋亡起到抗肝癌的作用。
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