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寻找新的农用抗生素是当今生物农药研究领域的一个重要课题,从海洋微生物中寻找有杀虫活性的抗生素更是研究的热点。本论文从初筛有效的13株海洋放线菌链霉菌属(Stretomycessp.)的菌株中复筛得到了对农业害虫甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和粉纹夜蛾(Trichoplusiani)杀虫效果最好的菌株海洋8号,对海洋8号菌株产生的活性成分分离纯化、结构鉴定和检测技术进行了系统的研究。
复筛试验结果表明:在13株海洋放线菌株菌丝浸提液和发酵液中,对甜菜夜蛾和粉纹夜蛾杀虫效果较好的是海洋8号、200-09和海洋10号菌丝浸提液,其他菌株菌丝浸提液以及发酵液杀虫效果不显著。对甜菜夜蛾2龄幼虫杀虫效果最好的是海洋8号,24h、48h和72h甜菜夜蛾的幼虫死亡率为80.00%、90.00%和100%,其次为菌株200-09,24h、48h和72h甜菜夜蛾的幼虫死亡率为63.33%,70.00%,90.00%,再次为海洋10号,24h、48h和72h甜菜夜蛾幼虫死亡率为36.67%、66.67%和96.67%;对粉纹夜蛾2龄幼虫杀虫效果最好的是海洋8号,24h、48h和72h甜菜夜蛾的幼虫死亡率为66.67%、90.00%和100%;其次为菌株200-09,24h、48h和72h甜菜夜蛾的幼虫死亡率为56.67%、66.67%和96.67%;再次为海洋10号,24h、48h和72h甜菜夜蛾幼虫死亡率为16.67%、73.33%和90.00%。复筛试验结果确定海洋放线菌海洋8号为本文的研究菌株。
对海洋8号菌株进行发酵培养,发酵菌丝用70%乙醇浸提浓缩,采用摇蚊(Chironomussp.)活性跟踪技术,对菌丝浸提液进行液液萃取,真空液相层析(VLC),硅胶柱层析和液相色谱制备分离,得到了有较高杀虫活性成分的纯品,通过质谱(ESI-MS)、核磁共振谱(包括IH-NMR、13C_NMR、IH.1HCOSY、nSQC和HMBC)各项光谱测定和波谱解析,对分离得到的杀虫组分进行了结构鉴定,确定它为staurosporine。
研究了杀虫成分的液相色谱(HPLC)定量检测技术。确定了液相色谱法检测的合适的色谱条件:C18反相柱(WATERSDelta,4lxm,250×4.60mm),紫外扫描波长292nm,甲醇/水为80:20,流速0.5mL/min,进样量IOBL,柱温40~C,脱气气体流速10mL/min。该方法测定海洋8号发酵浸提液中杀虫活性成分的线性范围为O.1-10pg;日内精密度变异系数1.1%,日间精密度为33%,说明检测方法精密度较高;高中低三个浓度的平均添加回收率分别为97.6、88.4、91.7%,变异系数≤3.2%,说明方法可靠;样品重现性试验变异系数1.9%,表明该方法具有较好的重现性;样品稳定性测定结果变异系数1.6%,表明样品测定结果稳定可靠。
本文较系统研究了海洋放线菌海洋8号产生杀虫活性组分的分离纯化技术,获得纯品并进行化学结构鉴定,确定了液相色谱定量检测技术,获得阶段性的研究成果,为进一步开发应用海洋放线菌海洋8号奠定良好的基础。