目的:本研究以丝裂原激活的蛋白激酶/胞外信号调节蛋白激酶（MAPK/ERK）信号转导通路为主要线索,通过制备大鼠含药血清、培养大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞（PC12细胞）、Elisa法检测细胞上清液中SOD、MDA、RT-PCR法检测细胞中ERK1/2基因表达情况,Western Blot法检测细胞中ERK1/2蛋白表达,观察并验证补肾健脑汤对Aβ_25-35诱导PC12细胞损伤具有保护作用,以MAPK/ERK1/2信号转导通路和氧化应激反应为切入点,从分子生物学的角度揭示补肾健脑汤对神经细胞损伤的预防保护作用机制,为补肾健脑汤治疗阿尔茨海默病提供初步实验依据及理论基础。材料与方法:第一部分,制备大鼠含药血清:将30只SD雄性大鼠按照随机数字表法随机分为空白对照组和补肾健脑汤低、中、高剂量组。按照临床用药的等效剂量,根据人和大鼠给药剂量换算关系计算大鼠给药剂量,计算得高剂量组给药浓度为14.4g/（Kg/天）,中剂量给药浓度为7.2g/（Kg/天）,低剂量组给药浓度为3.6g/（Kg/天）。以大鼠每天每公斤体重最大给药量为20ml/kg为标准,所有的给药组均每天上午灌胃一次,空白对照组灌等体积生理盐水,连续灌胃5天。在第5天灌胃1小时后,各组大鼠进行腹腔麻醉,通过大鼠腹主动脉采血。采血后,将样品静置2h,3000r/min离心10分钟,将血清分离,灭活、过滤,根据不同的组别将血清分装好,做好标记,放置-20℃的冰箱中保存备用。第二部分,细胞实验:细胞分组:根据实验要求,将PC12细胞分为以下五组（1）模型组:补肾健脑汤对照组大鼠血清+Aβ_25-35（2）补肾健脑汤低剂量组:补肾健脑汤低剂量组大鼠血清+Aβ_25-35（3）补肾健脑汤中剂量组:补肾健脑汤中剂量组大鼠血清+Aβ_25-35（4）补肾健脑汤高剂量组:补肾健脑汤高剂量组大鼠血清+Aβ_25-35（5）空白对照组:补肾健脑汤对照组大鼠血清以上每组对应的含药血清都稀释为10%、15%、20%三个浓度。Aβ_25-35均稀释为10umol/L、20umol/L、40umol/L三个不同的浓度进行干预。采用MTT检测细胞OD值的方法筛选Aβ_25-35最适宜的造模浓度、造模时间以及最合适的含药血清浓度。将补肾健脑汤模型组、补肾健脑汤低、中、高剂量组和空白对照组大鼠血清分别配制成10%、15%、20%含药血清的细胞培养基,保存备用。选择对数生长期的PC12细胞,调节细胞浓度按照l×10⁴个/ml密度,接种于每孔为200μL体系的96孔板中培养。培养24小时观察到细胞贴壁生长后,细胞饥饿12h（即换用无胎牛血清的培养基继续培养12小时）使细胞同步化。之后吸去原培养液,向各组中加入对应的含相应浓度大鼠血清的细胞培养基,除空白对照组外,将终浓度分别10umol/L、20umol/L、40umol/L的Aβ_25-35加入到细胞培养基中,继续培养,在培养时间段分别为12小时、24小时、48小时,用MTT法检测各组细胞吸光度即OD值,根据光度值筛选出Aβ_25-35诱导PC12细胞损伤的最佳作用时间、造模药剂量及最合适的含药血清浓度。条件摸索完之后,按照方案继续实验。显微镜下观察细胞形态,收集细胞上清液和细胞,保存。Elisa法检测各组细胞上清中SOD、MDA的含量,western blot法检测细胞中ERK1/2和P-ERK1/2的蛋白表达,使用RT-PCR法检测ERK1/2mRNA表达。分析探讨补肾健脑汤含药血清对Aβ_25-35诱导PC12细胞损伤的保护机制以及与MAPK/ERK1/2信号转导通路的作用关系。结果:第一部分:MTT法筛选造模条件1.造模时间的选择:在含药血清浓度和造模药浓度相同的条件下,将不同的时间为纵坐标做成柱状统计图进行比较,结果选择作用24h为最佳。2.造模药浓度选择:在含药血清浓度相同,作用时间为24h的条件下,将不同造模药浓度为纵坐标做柱状统计图,经比较,选择20umol/L的Aβ_25-35的浓度最佳。3.含药血清浓度选择:在造模药为20umol/L,将12h、24h、48h三个时间点的含药血清浓度为纵坐标分别做柱状图,经比较发现,含药血清为15%的培养基为实验选择的最合适条件。第二部分:补肾健脑汤对Aβ_25-35诱导PC12细胞损伤的保护机制1补肾健脑汤含药血清对Aβ_25-35诱导的PC12细胞形态的影响在倒置显微镜下观察到,空白对照组细胞密布于视野,形状为梭形,包体饱满;模型组活细胞数量变少,有瘪缩、漂浮现象;补肾健脑汤组细胞活力较模型组增强,重新密布视野,伪足伸出,瘪缩渐复,生长状态转佳。2.补肾健脑汤含药血清对Aβ_25-35诱导PC12细胞中MDA含量的影响与模型组相比较,正常对照组细胞内MDA含量较低（P≤0.05）;与空白对照组比较,模型组细胞内MDA含量显著性增加（P≤0.05）;与模型组相比较,补肾健脑汤中、高剂量组细胞内MDA含量显著性下降（P≤0.05）;补肾健脑汤低剂量组与模型组比较,细胞内MDA含量降低,但差异无统计学意义（P≥0.05）。3.补肾健脑汤含药血清对Aβ_25-35诱导的PC12细胞S0D含量的影响与模型组比较,正常对照组细胞内S0D表达量较高（P≤0.05）;与模型组比较,补肾健脑汤低、中、高剂量组细胞中S0D表达量显著升高（P≤0.05）。补肾健脑汤高剂量组细胞中S0D表达量升高最显著。4.补肾健脑汤含药血清对Aβ_25-35诱导的PC12细胞ERK1/2mRNA表达的影响与正常对照组比较,模型组细胞内ERK1/2的mRNA表达显著降低（P≤0.05）。与模型组比较,补肾健脑汤中、高剂量组和补肾健脑汤高剂量+ERK1/2抑制剂组细胞内ERK1/2的mRNA表达均升高（P≤0.05）;与补肾健脑汤高剂量组相比较,补肾健脑汤高剂量+ERK1/2抑制剂组细胞内ERK1/2mRNA表达明显降低（P≤0.05）。5.补肾健脑汤含药血清对Aβ_25-35诱导的PC12细胞中ERK1/2蛋白表达的影响与正常对照组比较,模型组细胞中ERK1/2和P-ERK1/2蛋白表达明显降低,差异有统计学意义（P≤0.05）;与模型组比较,补肾健脑汤低、中、高剂量组细胞内ERK1/2蛋白表达增加,差异均有统计学意义（P≤0.05）。与补肾健脑汤高剂量组相比较,补肾健脑汤高剂量+ERK1/2抑制剂组细胞内ERK1/2蛋白表达明显下降（P≤0.05）。结论:1.补肾健脑汤含药血清能够保护Aβ_25-35损伤的PC12细胞,其中15%浓度的补肾健脑汤含药血清,20umol/L的Aβ_25-35干预24h,最适合该实验的造模条件。2.补肾健脑汤含药血清对Aβ_25-35诱导的PC12细胞具有保护作用。其作用机制可能是保持PC12细胞膜结构完整,维持PC12细胞形态规则,降低PC12细胞MDA含量,增加细胞SOD活性,增强细胞抗氧化能力,减少氧化应激对细胞的损伤。3.补肾健脑汤含药血清能够显著性上调ERK1/2mRNA的表达,提高ERK1/2蛋白磷酸化水平,提示补肾健脑汤含药血清对Aβ_25-35诱导的PC12细胞的保护作用可能有MAPK/ERK1/2信号通路参与。