研究背景：　　肺癌与慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是呼吸系统最常见的两种疾病，两者关系极为密切。研究发现40-70％的肺癌患者伴发　　COPD，而COPD患者的肺癌年发病率高达16.7/1000人年，远超正常人群。我们前期开展的meta分析也显示COPD患者发生肺癌的危险度是正常人的2.76倍。COPD可能是肺癌癌前病变的一种中间表型，其在吸烟所致的癌变过程中存在中介效应。因此，对人群COPD的筛检有助于肺癌的早期预防。对比分析国内外多个有关肺癌和COPD的流行病学研究，我们发现两种疾病的环境病因和遗传易感位点存在广泛的重叠，这提示肺癌与COPD可能具有共同的发病机制，这些机制也可能是COPD患者肺癌高发的病理基础。　　肺癌和 COPD的发病机制十分复杂，基因和环境因素相互作用，共同影响了两种疾病的进程。吸烟是两者最主要的病因。我们通过比对有关肺癌、COPD及肺功能的全基因组关联研究（GWAS），结果发现三者的易感基因在人类染色体上有广泛的重叠，如位于人类染色体15q24区上的尼古丁受体基因家族（CHRNA3-CHRNB4-CHRNA5）、过氧化物歧化酶3（Superoxide dismutase3，SOD3）、mutS同源物6（mutS homolog6，MSH6）和钙粘着蛋白关联蛋白（cadherin-associated protein alpha2，CTNNA2）等。在体内，上述基因主要参与胞外信号识别和磷酸化信号传导、氧化应激、DNA损伤修复和上皮细胞间质化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等过程。目前，研究已证实尼古丁受体和 EMT与肺癌和 COPD的发病，以及 COPD发展为肺癌的过程相关；而磷酸化信号传导、氧化应激、DNA损伤与修复等胞内活动也都参与了肺癌和 COPD的发病过程。此外，上述途径之间还存在相互串话（cross-talk）机制。基于上述GWAS的结果和有关肺癌与COPD病理机制的报道，我们推测，肺癌与 COPD可能存在共同的发病机制：环境因素作用于化学物受体，刺激细胞氧化应激反应，直接损伤基因组 DNA和诱发 EMT；同时环境因素与受体结合后产生应激信号，经磷酸化信号通路级联放大和转移至核内，激活或抑制相关转录因子，调控氧化应激反应和EMT进程，共同促进肺癌和COPD的发生。　　目前，对于肺癌与COPD的关系认识，多数是来源于肺癌的病例-对照研究或临床特征描述；对肺癌和COPD可能具有的共同环境病因和基因易感位点的认识，也都来自于各自独立的疾病研究；肺癌的关联研究中往往忽视了对COPD效应的分析。因此，本研究通过在广州、苏州两中心，同时进行肺癌病例与对照、COPD病例与对照的平行研究，（1）揭示肺癌与COPD的共同环境危险因素，评价COPD在这些共同病因致肺癌发生中的中介效应；（2）沿着“受体→信号传导途径→转录调控因子→氧化应激、DNA损伤和EMT→肺部疾病”的研究思路，分析了尼古丁受体家族、氧化还原酶WWOX和EMT调控基因的遗传变异【包括单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）和拷贝数变异（copynumber variation，CNV）】与肺癌和COPD发病及预后的关联，并探索阳性关联位点的生物学功能，阐述肺癌与COPD的共同遗传易感分子。以期从基因和环境以及基因-环境交互效应层面揭示肺癌与COPD的共同发病机制，从而为两病的预防与控制提供新的思路和科学依据。　　第一部分：肺癌与COPD的共同病因及COPD中介效应分析　　肺癌与COPD的关系极为密切。既往多个流行病学研究显示两者环境病因谱有广泛的重叠，如吸烟、被动吸烟、职业暴露、肺部疾病史等。然而当前对肺癌和COPD环境病因的研究都是独立开展的，地区、时间和种族间的异质性让我们很难比较这些病因在肺癌和 COPD的效应差异，且目前仍未有研究系统化地阐述两者的共同病因。另外，近期国外有研究发现COPD在吸烟导致的肺癌危险效应中起着中介作用。其他病因亦可能在致肺癌的过程中起着类似效应，但尚未有研究报道。　　目的：　　揭示肺癌与COPD的共同环境病因谱及评价COPD在肺癌发病中的中介效应，分析肺癌和COPD的外在联系，为两病的综合预防提供科学依据。　　方法：　　在广州和苏州两地开展肺癌和COPD独立的病例-对照研究。其中，肺癌的研究包括广州地区肺癌病例1056例和正常健康对照1056例，苏州地区肺癌503例和对照623例；COPD的研究包括广州地区COPD病例1025例和肺功能正常对照1061例，苏州地区COPD病例486例和对照616例。对照皆按与病例性别相同、年龄（±5岁）以频率配比的方法，从参加健康体检项目的人群中进行随机选择。问卷收集个体特征和环境暴露等22个项目信息。采用SAS9.3软件进行多因素logistic回归模型分析，揭示肺癌和 COPD的共同环境暴露因素。利用无顺序多变量 Logistic回归模型和Sobel检验评价COPD在共同因素致肺癌发病过程中的中介效应。　　结果：　　肺结核史、肺气肿史、吸烟（或吸烟量）、被动吸烟、职业接触金属毒物、住房通风差、使用生物燃料和少食蔬菜水果8项暴露因素能显著增加肺癌和COPD的发病风险，其危险效应方向一致。进一步的无顺序多变量Logistic回归模型显示，吸烟和使用生物燃料对COPD人群发生肺癌风险的增加效应（吸烟：OR=3.13；生物燃料：OR=2.99）显著高于非COPD人群（吸烟：OR=1.31；生物燃料：OR=1.34）（P值分别为4.53×10-6和8.42×10-5），且COPD在吸烟和生物燃料的致肺癌发病效应中具有显著的中介作用，分别占据总效应的13.1%和6.1%（Sobel检验：P值分别为0.005和0.039）。　　结论：　　肺癌与 COPD的环境病因谱存在广泛的重叠。COPD在吸烟和生物燃料的致肺癌效应中具有中介效应，提示吸烟者和生物燃料使用者倾向于先发生COPD再发展为肺癌，这为肺癌和COPD的人群预防提供了新的思路。　　第二部分：肺癌与COPD的共同遗传易感性研究　　第一节尼古丁受体3（CHRNA3）基因遗传变异与肺癌和COPD发病及预后的关系　　人类15号染色体长臂24区（15q24）是已明确的肺癌和COPD的易感基因区段，位于该区域内的尼古丁受体家族基因簇（CHRNA3-CHRNB4-CHRNA5）上的多个遗传变异被报道与肺癌、COPD、肺功能和吸烟行为存在显著关联。我国人群的研究同样报道了该区域还存在一个功能性的SNP rs6495309，其与肺癌发病和吸烟行为密切相关，但我国人群尚未有研究进行上述基因变异与COPD发病关联的探索。此外，吸烟可影响肺癌及 COPD的预后，这些 SNPs极有可能通过介导吸烟行为而影响肺癌或COPD的预后。因此，我们假设位于人类15q24区上的多态位点可能与我国人群肺癌和COPD的发病及预后相关。　　目的：　　分析人类15q24区上的SNPs在我国人群肺癌和COPD发生、发展中的作用。　　方法：　　利用连锁不平衡分析（Linkage disequilibrium，LD）于GWAS报道的关联SNPs中筛选出CHRNA3基因上两个功能性的SNPs（rs6495309T>C和rs1051730G>A），通过PCR-RFLP的方法检测前述人群的两SNPs的基因型，用多因素logistic回归模型和Log-Rank检验以及Cox回归模型分别评估两SNPs与疾病发病和预后关联。针对阳性关联位点rs6495309T>C，构建萤光素酶报告基因系统，分析T等位基因与C等位基因的转录活性，并通过毒理学实验，检测两等位基因对烟草凝集物、尼古丁、烟草亚硝胺（NNK）和苯并芘（BaP）刺激的敏感性差异。　　结果：　　rs6495309T>C与肺癌的关联符合显性遗传模型，rs6495309C变异基因型（CC+TT）能显著增加肺癌的发病风险（OR=1.57，95%CI=1.31-1.87），缩短肺癌患者的生存期，增加肺癌患者的死亡风险（HR=1.41，95%CI=1.13-1.75）；其与COPD的关联符合隐形遗传模型，CC基因型能显著增加 COPD的发病风险（OR=1.32，95%CI=1.14-1.54），加快肺功能下降，且与 COPD进展呈显著正相关（P=0.033）。rs6495309T>C变异还与吸烟行为存在显著的交互效应。体外实验发现，相较T等位基因，携带C等位基因的启动子转录活性更高，烟草凝集物和尼古丁刺激能显著扩大两等位基因之间的活性差异。而 rs1051730G>A与肺癌和 COPD的发病及预后的关联皆没有显著性。　　结论：　　CHRNA3基因SNP rs6495309C变异可显著增加其基因的转录活性，提高机体细胞对毒物的敏感性，且与吸烟存在基因-环境交互效应，使得人群携带者对肺癌和COPD更为易感，病患携带者的肺癌和COPD预后更差。　　第二节尼古丁受体7（CHRNA7）基因拷贝数变异与我国人群肺癌和COPD发病及预后的关联研究　　拷贝数变异（CNV）是基因组内广泛存在的一种较大片段的遗传变异，指的是1 kb以上基因组大片段的拷贝数增加或者减少。相较单个位点核苷酸（SNP）的变化，CNV更易于引起基因的结构异常和表达水平的变化，从而影响疾病的发生与发展。可以预见，位于疾病易感基因上的 CNVs极有可能影响人群疾病易感性。由此，我们假设位于尼古丁受体基因上的 CNVs可影响尼古丁基因功能而与我国人群肺癌和COPD发生、发展相关。　　目的：　　探索尼古丁受体家族基因拷贝数变异与肺癌和COPD的发病及预后的关系，阐明其生物学机制。　　方法：　　参考基因组变异数据库（Database of Genomic Variants，DGV），从11个神经性尼古丁受体家族基因（CHRNA2、CHRNA3、CHRNA4、CHRNA5、CHRNA6、CHRNA7、CHRNA9、CHRNA10、CHRNB2、CHRNB3和 CHRNB4）中选取中国人群拷贝数变异频率>5%的拷贝数变异，分别为CHRNA7基因的CNV-3956和CHRNA10基因的CNV-3833。在前期病例-对照研究的基础上，利用中通量Accucopy法进行初步检测，筛选潜在的阳性关联位点，进而用Taqman实时定量技术进行大样本的基因型鉴定。进一步在肺组织中检测CHRNA7基因的表达水平，分析基因型-表型的关联。　　结果：　　CHRNA7基因CNV-3956与肺癌的关联符合隐性遗传模型，携带4-copy基因型个体的肺癌发生风险是携带2、3-copy基因型个体的1.49倍（ OR=1.49，95%CI=1.29-1.73）；且4-copy基因型肺癌患者肺癌生存期显著短于后者（中位生存期：11月vs.14月；HR=1.25，95%CI=1.07-1.45）；CNV-3956与COPD的关联符合显性遗传模型，相较2-copy基因型携带者，3/4-copy基因型携带者发生COPD的风险增加了45%（OR=1.45，95%CI=1.26-1.66），第一秒用力呼气量（pre-Forced expiratory volume in one second，pre-FEV1）更低（P=1.46×10-5），且 FEV1值下降的更快（-0.113±0.156 vs.-0.078±0.099；t检验：P=0.034）。此外，CNV-3956与吸烟在增加肺癌和COPD发病风险上有显著的交互作用。进一步分析CNV-3956拷贝数与吸烟量关系发现其与吸烟包年数成正相关（P=4.00×10-4）。　　在肺癌组织中，CNV-3956拷贝数与CHRNA7基因mRNA和蛋白质水平呈显著正相关（mRNA：P=0.049；蛋白质：P=0.013）。本研究未发现CHRNA10基因CNV-3833与肺癌或COPD的发病或预后存在显著关联。　　结论：　　CHRNA7基因拷贝数变异CNV-3956可改变其基因表达，影响吸烟者吸烟量，从而改变肺癌和COPD发病的风险及预后，它可能是一个潜在的生物标志物，用于预测肺癌和COPD的发病风险和预后评价。　　第三节 EMT调控子Snai1基因外显子Val118Ala变异能降低我国人群肺癌和COPD的发病风险　　上皮细胞间质性转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞转分化为间质性细胞。近年来，大量研究提示EMT可促进肺癌和COPD的发生发展。GWAS亦报道了EMT相关基因的遗传变异与肺癌和COPD的发病相关。在机体内，EMT主要由多个核内转录因子即EMT调控子所调控，这些分子发挥控制EMT过程的“开关”效应，可以下调上皮细胞标志物的表达，并上调间质细胞标志物的表达。目前，已有多个EMT调控子被报道。其中，锌指蛋白家族的Snai1和Slug，E盒结合锌指蛋白Zeb1和Zeb2，以及基本螺旋环螺旋因子Twist1受到广泛关注。因此，我们假设位于 EMT调控子基因上的潜在功能性多态可能通过单独或联合效应影响EMT的过程，最终导致肺癌或COPD易感。　　目的：　　探究与肺癌和COPD发生发展相关的EMT调控分子的潜在功能性SNPs，并探明其生物学机制。　　方法：　　参考dbSNP数据库，针对Snai1，Slug，Zeb1，Zeb2和Twist1这5个主要的EMT调控子，选取位于各编码基因启动子区（上游-2000bp）、5’-非翻译区、外显子区和3’-非翻译区的常见（低发等位基因频率>5%）潜在功能性多态位点，共7个SNPs，以Taqman基因分型技术检测各SNP的基因型。针对所发现的阳性关联位点，Snai1基因外显子变异（Val118Ala），构建含不同等位基因的pcDNA3.1表达载体，转染人肺细胞系A549和16HBE，镜下观察细胞形态变化，利用划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力，采用荧光定量PCR和Western blot法检测受Snai1转录调控的EMT标志分子E钙粘着蛋白（E-cadherin，CDH1）、纤连蛋白（Fibronectin，FN）和波形蛋白（Vimentin，VIM）的表达，分析携带不同118位氨基酸的Snai1蛋白的转录调控能力和促EMT效应差异。　　结果：　　Val118Ala变异与肺癌和COPD的发病显著相关，相较于118Ala纯合基因型携带者，118Val杂合基因型和纯合基因型携带者发生肺癌的风险下降24%（OR=0.76，95%CI=0.65-0.90），发生COPD的风险下降了22%（OR=0.78，95%CI=0.65-0.93）；118Val基因型降低肺癌风险的效应在COPD人群中更显著（P=0.001）；Val118Ala还与肺癌吸烟患者的肿瘤分期相关（P=0.013），118Ala变异基因型能显著降低吸烟患者肿瘤发生转移的概率。体外功能实验表明，过表达 Snai1-118Ala蛋白的细胞，其迁移和侵袭能力及间质化细胞特征皆弱于过表达Snai1-118Val的细胞；Snai1-118Ala上调间质细胞标志物FN和Vim的幅度显著低于Snai1-118Val，但两者对上皮标志物E-cad表达的调控无显著性差异。此外，本研究未发现其他EMT调控子的SNPs与肺癌或COPD的发病及预后有显著关联。　　结论：　　EMT调控子Snai1基因外显子Val118Ala的遗传变异能影响该基因的转录调控能力，延缓肺上皮细胞的间质型转化，从而降低肺癌和COPD的发病风险，其对肺癌的保护效应在COPD人群中更为显著。　　第四节氧化还原酶WWOX基因拷贝数变异影响我国人群肺癌和COPD的易感性　　氧化应激（Oxidative Stress）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，产生过氧化物和氧自由基，导致中性粒细胞炎性浸润，损伤机体细胞成分如DNA。氧化应激参与肺癌和 COPD的发生发展。近期一项在欧洲人群开展的 GWAS发现，位于编码 WW结构域氧化还原酶（WWOX）基因上的遗传变异（rs12716852）与肺功能有显著关联，而我们前期研究也发现该基因SNPs与我国人群的肺癌发病相关，提示该基因可能是肺癌和 COPD共有的易感基因。WWOX基因位于人类染色体普通脆性位点FRA16D（16q23~16q24.1）内，该区域存在大量的拷贝数变异（CNVs）。这些拷贝数变异极有可能影响WWOX的基因结构或表达，从而与人群肺癌或COPD的易感性相关。因此，我们假设位于 WWOX基因上的 CNVs可影响我国人群的肺癌和COPD易感性。　　目的：　　研究氧化还原酶WWOX基因拷贝数变异与我国人群肺癌和COPD发病的关联。　　方法：　　利用 Taqman实时定量技术检测前述人群 WWOX基因常见的拷贝数变异CNV-67048，应用ACCUCOPY assay和Affymetrix Genome-Wide HumanSNP Array6.0芯片验证 Taqman技术结果检测的准确性。对 WWOX进行转录子测序，分析CNV-67048与WWOX外显子缺失的关系，并采取real-timePCR、western blot实验检测肺组织内WWOX基因的mRNA和蛋白表达水平，分析基因型-表型关联，以揭示该遗传变异的生物学功能。　　结果：　　CNV-67048拷贝数变异与肺癌发病风险呈显著的剂量-效应关系（Ptrend=1.12×10-10）。与野生2-copy基因型携带者比较，缺失基因型（1-拷贝或者0-拷贝）携带者发生肺癌的风险上升了40%（OR=1.40，95%CI=1.20-1.63）。CNV-67048基因型为缺失型的肺癌组织，其发生 WWOX外显子6-8缺失的概率也显著增加（P=0.021），其WWOX基因的表达水平也显著低于2-copy基因型组织（P<0.05）。此外，该遗传变异同样与 COPD的发病相关，缺失基因型（1-拷贝或者0-拷贝）携带者发生 COPD的风险是2-copy野生基因型携带者的1.30倍（ OR=1.30，95%CI=1.12-1.50）。　　结论：　　WWOX基因缺失型拷贝数变异CNV-67048与我国人群发生肺癌和COPD的易感性存在显著关联。其生物学机制可能是缺失型CNV-67048可增加WWOX发生外显子6-8缺失的概率，导致WWOX表达低下或不表达，进而引起机体的氧化修复能力异常，从而促进肺癌和 COPD的共同发病。CNV-67048可作为预测我国人群肺癌和COPD发病风险的一个潜在的共同易感标志物。　　研究总结：　　肺结核史、肺气肿史、吸烟（或吸烟量）、被动吸烟、职业接触金属毒物、住房通风差、使用生物燃料和少食蔬菜水果是肺癌和 COPD的共同环境暴露危险因素；而CHRNA3、CHRNA7、EMT调控子Snai1和氧化还原酶WWOX基因的遗传变异是两种疾病的共同易感基因位点。