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本研究根据GenBank数据库中发表的禽流感(AIV)的M基因，新城疫(NDV)的F基因，传染性支气管炎(IBV)的N基因，禽流感的H5亚型(AIV-H5)、H7亚型(AIV-H7)、H9亚型(AIV-H9)的HA基因以及新城疫强毒(NDV(F48E9))和弱毒(NDV(Lasota))的F基因，分别在其基因保守区按照多联PCR反应引物设计原则，设计出八对特异性引物，扩增片段大小分别为385bp(AIV)、520bp(NDV)、748bp(IBV)、490bp(AIV-H5)、365bp(AIV-H7)、686bp(AIV-H9)、259bp(NDV(F48E9))、522bp(NDV(Lasota))，分别建立八种病毒或毒株的单项RT-PCR检测方法。通过琼脂糖凝胶电泳初步鉴定PCR产物后，对PCR产物纯化回收、克隆测序进行进一步鉴定，相似性均达到96％以上，结果证明所扩增的产物均为特异性核酸片段。
在进行RNA反转录合成cDNA第一链时，运用特异性引物和随机引物分别诱导反转录合成cDNA作为模板进行PCR扩增，比较两者诱导反转录时对PCR扩增的影响，结果显示：两种方法诱导反转录时对PCR扩增效果无明显差异，且在多联RT-PCR反应时用随机引物引导反转录可以避免运用多对特异性引物诱导反转录多次加样的麻烦以及避免反转录后多余的特异引物对多联PCR反应引物浓度的优化造成的麻烦。
在建立单项RT-PCR检测方法时，对各引物PCR反应时的退火温度、引物浓度、镁离子浓度等进行了优化。在此基础上，通过优化组合，按AIV-NDV-IBV，H5-H7-H9，NDV强、弱毒分别组合成多联RT-PCR反应，分别对各多联RT-PCR反应的引物浓度、共同的退火温度进行了优化。根据多联RT-PCR反应优化结果，建立了AIV-NDV-IBV多联RT-PCR，H5-H7-H9 AIV多联RT-PCR及NDV强毒、弱毒多联RT-PCR诊断体系。对该方法进行了敏感性、特异性、稳定性、重复性实验，结果显示：该诊断方法敏感性高，对特异病毒核酸检测的敏感度分别为：AIV 100pg、NDV 100pg、IBV 1000pg、AIV-H5 1000pg、AIV-H7 100pg、AIV-H9 1000pg、NDV(F48E9)10pg、NDV(Lasota)10pg：特异性强，均能够特异地检测出相应的病毒；稳定性和重复性都较好，为研制成分子生物学诊断试剂盒奠定了良好的基础。运用该方法分别对人工发病和自然发病出现典型症状的病死鸡组织进行检测，结果都能检测出特异的病毒，为该方法的进一步临床应用作好了准备。