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目的：骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein 2,BMP2)是目前已知的具有最强促进异位成骨能力细胞因子,血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)能显著促进血管再生有利于骨缺损的愈合。BMP2和VEGF两种蛋白的分泌存在相互促进的正反馈作用。骨缺损的愈合,尤其是在愈合过程的初期,是在低氧环境下进行的。骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSC)具有向骨形成细胞和血管形成细胞等多种细胞分化的潜能。本课题研究模拟低氧环境下同时转染hBMP2和VEGF基因的BMSC在成骨方面的相关特性。方法：1.大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)的分离、培养利用Percoll分离液(相对密度1.077),用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离骨髓基质干细胞,进行体外培养及扩增。2.通过形态学观察和生长曲线的测定及Elisa,观察BMSC转染hBMP-2的腺病毒载体(Ad-hBMP-2)和VEGF的腺病毒载体(Ad-VEGF)后生物学行为的变化和目的基因的表达。BMSC转染绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的腺病毒载体(Ad-GFP)后,使用荧光显微镜来测定腺病毒的转染效率,并观测转染Ad-GFP的细胞传代后绿色荧光蛋白的表达情况。3.MTT法检测低氧控制系统下,转染Ad-hBMP-2和VEGF的BMSC细胞增值及活力取第二代骨髓基质干细胞进行实验,实验分为四组：(1)BMSC培养组；(2)Ad-hBMP-2+BMSC培养组；(3)VEGF+BMSC培养组；(4)Ad-hBMP-2+VEGF+BMSC培养组。体外连续培养7天,分别在此期间内用MTT法检测各组细胞的增值能力,酶标仪测定光密度值(OD值),每个样本设六个复孔,求其平均值并绘制细胞生长曲线。4.低氧控制系统下,检测转染Ad-hBMP-2和VEGF的BMSC成骨能力取第二代骨髓基质干细胞进行实验,实验分为四组：(1)BMSC培养组；(2)Ad-hBMP-2+BMSC培养组；(3)VEGF+BMSC培养组；(4)Ad-hBMP-2+VEGF+BMSC培养组。96孔板内于低氧控制系统下,连续诱导培养6天,分别在此6天内用PNPP法检测各组细胞的碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)的活性的表达；酶标仪测定光密度值(OD值),每个样本设五个复孔,求其平均值,并绘制ALP活性增长曲线；6孔板内四组样本体外连续诱导培养7天,在第7天行茜素红染色,观察矿化结节形成情况。结果：1.密度梯度离心法,可获取高纯度的BMSC,并且细胞活性较好。贴壁3天后细胞成长为梭形及多角形,5、6天后增殖迅速,形成细胞集落。传代后细胞形态更加单一,5、6天后即可铺满瓶底。2.体外实验转染骨髓基质干细胞。Ad-GFP转染12小时后即可检测到绿色荧光蛋白表达,转染2天后平均转染效率为90%,传至5代后依然可检测到绿色荧光蛋白表达。3.MTT法检测低氧控制系统下,转染Ad-hBMP-2和Ad-VEGF的BMSC细胞增值及活力显示：第1、2天各组细胞数量没有明显增加,各组间细胞增殖能力统计学上没有显著性差异(P>0.05)；第3天后,各组细胞数量明显增加,转染Ad-hBMP-2的细胞增殖能力在统计学上显著高于其他培养组(P<0.01),转染Ad-VEGF细胞增殖能力与空白组无显著性差别(P>0.05)。4.低氧控制系统下,检测转染Ad-hBMP-2和VEGF的BMSC成骨能力1)PNPP法检测各组ALP活性表达,结果显示：Ad-hBMP-2+VEGF+BMSC培养组细胞成骨诱导培养后,ALP活性表达统计学上显著高于其他三组(P<0.05);Ad-hBMP-2+BMSC成骨诱导培养组高于BMSC组和VEGF+BMSC组(P<0.05)；BMSC组和VEGF+BMSC组无显著差别(P<0.05)。2)低氧控制系统下,4组样本培养7天后,茜素红染色结果显示：Ad-hBMP-2+VEGF+BMSC成骨诱导培养组细胞密集生长区有多量矿化结节形成,茜素红染色成橘红色。Ad-hBMP-2+BMSC和VEGF+BMSC成骨诱导培养组细胞有少量矿化结节。BMSC成骨诱导培养组只有零星几个矿化结节。结论：在一周的培养时间内,骨形态形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein2,BMP2)可以增强骨髓基质干细胞(BMSC)的成骨活性；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)短期内对BMSC成骨活性影响和对照组无统计学差异；BMP-2和VEGF联合作用比单独转染BMP-2更能显著提高BMSC的成骨活性。