木质纤维素是一类丰富的可再生生物质能源,每年的产量占地球光和作用产生生物总量的60％左右。木质纤维素成分复杂,由纤维素、半纤维素和木质素等物质构成,自然界中木质纤维素的降解主要由微生物分泌的各种多糖降解酶完成。反刍动物瘤胃是高效降解木质纤维素的系统之一,其中含有降解木质纤维素的微生物菌群,并与非纤维降解微生物共同作用将木质纤维素转化为动物营养。　　 本文从牦牛瘤胃中分离到一株纤维素降解细菌,并研究了其纤维降解酶系的特征。主要结果如下:　　 通过改进富集培养方法,利用Hungate厌氧培养技术从瘤胃内容物中分离到一株厌氧细菌菌株H1。该菌能够降解纤维素和半纤维素,其形态、生理生化和系统发育学特征的分析表明与已发表的细菌差别显著,代表了新的分类单元,因此建立了一个新属新种,命名为Cellulosilyticum ruminicola(菌株H1 T=CGMCC1.5065T=JCM14822 T)。　　 我们首先测定了菌株H1的基因组序列,发现该基因组中含有一系列和降解植物细胞壁物质有关的酶基因。该菌培养液的纤维降解酶活分析发现其产生内切纤维素酶、外切纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶、阿魏酸酯酶、乙酰酯酶以及一些植物多糖降解相关的糖苷酶活。其中约一半的外切纤维素酶(50％)和阿魏酸酯酶(45％)、约三分之一的木聚糖酶(31％)和内切纤维素酶(36％)紧密结合在结晶态纤维素上,只有一小部分甘露聚糖酶(6.78％)和果胶酶(1.76％)结合到纤维素上。肽质谱结合基因组数据分析表明微晶纤维素结合蛋白大多具有碳水化合物结合域(CBM),结合量最大的两个蛋白为GH48和GH9家族的纤维素酶,但没有检测到纤维小体的特征蛋白结构域。说明该菌的纤维素酶以游离蛋白而非纤维小体复合物的形式存在。同时也没有检测到菌株H1产生的降解纤维素酶复合体。Blue Native PAGE和离子交换层析组分的酶活分析显示该菌可能产生降解木聚糖的蛋白复合体。　　 论文还研究了吸附于纤维素的外切纤维素酶Ce148A和内切纤维素酶Ce19A蛋白C端的一段未知功能域(Uk)。通过异源表达Ce148A的全长蛋白、无Uk结构域的截短蛋白及Uk结构域的外切纤维素酶活及纤维素结合活性,证明Uk结构域是外切纤维素酶Ce148A的纤维素结合域(CBM)。底物结合实验证明Uk结构域结合可溶态和结晶态的纤维素及几丁质,但不能结合木聚糖和甘露聚糖,可能属于CBM中Type A和B的混合类型,主要结合葡萄糖主链以β-1,4-糖苷键连接的碳水化合物。Uk结构域与相关CBM的系统发育分析表明其属于CBM3家族,但同该家族中已知的三个亚家族的相似性均比较低(同3a、3b、3c亚家族的一致性分别为28％、24％和21％)。Uk结构域存在于Cellulosilyticumruminicola及与之近缘的细菌中,同时均位于木质纤维素降解酶上。二级结构基础上的同源序列比对显示,以Uk为代表的CBM3类群在序列上具有如下特点:在strandβ4’上游有一个保守的Pro66-Trp67插入,strandβ6前具有一段序列缺失及strandβ8,β9不完整。进一步分别测定了Uk结构域6个芳香族氨基酸突变体的纤维素结合能力,结果表明其中Phe62和Trp67是CBM3中首次发现的新类群中特有的纤维素结合位点。Uk结构域的蛋白三维结构模拟显示,该结构域除了具有已经发现的纤维素结合位点外,可能还具有另一个由Trp67参与构成的新的结合位点,解释了Uk能够结合结晶态和可溶态两类碳水化合物的现象。根据底物结合类型、序列同源性及三维结构特征,我们提出了一个新的CBM亚家族(CBM3d)。