非洲菊GMAP1基因在拟南芥中异源表达的功能研究

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本实验室从非洲菊(Gerbera hybrida)中克隆了3个GMAP如(Gerberamicrotubule-associated protein1)基因(GMAP1-a,GMAP1-b,GMAP1-c),系统发育分析发现GMAP1s基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)自噬相关基因(Autophagy-related genes,ATGs) AtATG8s具有较高的同源性。已经有文献报道AtATG8基因在胁迫条件下能够延缓植物衰老。为了便于研究非洲菊GMAP1基因的功能,本实验室前期的工作已经将3个GMAP1s基因异源转化到拟南芥中。在本研究中通过观察三种转基因拟南芥的黑暗及缺氮诱导表型,发现黑暗诱导条件下GMAP1基因具有促进衰老的功能,因此,选择OE-GMAP1-a拟南芥作为代表,从形态、生理生化和分子水平研究了GMAP1基因的促进衰老功能。为了进一步探究GMAP1基因与同源AtATG8基因功能差异的原因,采用基因定点突变的方法改变所预测的关键氨基酸位点,以期通过观察转基因拟南芥衰老表型变化来阐明非洲菊GMAP1基因与其同源基因AtATG8功能相反的原因。主要研究结果如下:  1.对GMAP1基因的三种转基因拟南芥进行黑暗及缺氮诱导表型观察发现,黑暗诱导条件下的衰老表型比缺氮诱导条件下的明显,这表明GMAP1基因主要响应碳胁迫信号而对氮胁迫并不敏感。  2.在黑暗诱导条件下GMAP1-a基因超表达能够促进植物叶绿素的降解、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的积累、死细胞的增加并且能够促进SEN1、ORE1、AtNAP、WRKY6和WRK Y53等衰老相关基因(Senescence-associatedgenes,SAGs)的表达,因而GMAP1-a基因在黑暗诱导下具有促进植物衰老的功能。  3.利用表达载体pCanG,构建了AtATG8f超表达载体以及82号氨基酸位点定点突变的M-AtATG8f和M-GMAP1-a超表达载体并转化拟南芥。对转基因植株的黑暗诱导表型观察,发现OE-AtATG8f株系和OE-M-AtATG8f株系的表型一致,OE-GMAP1-a株系和OE-M-GMAP1-a株系的表型一致,这表明GMAP1-a和AtATG8f蛋白82号位的定点突变对蛋白的功能没有产生影响。  以上结果表明,决定GMAP1-a和AtATG8f功能的关键氨基酸位点可能有多个而不是单个氨基酸,这两个同源基因功能却相反的原因还需进一步探讨。本研究结果丰富了对ATG8基因家族在调控植物衰老方面作用的认识,也为进一步阐明自噬与衰老的关系提供理论依据。  
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