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脂肪酶能催化酯键水解及其逆向反应，即在非水相体系中催化酯合成和转酯反应，是最常用的工业用酶之一。它们广泛存在于动物组织、植物种子和微生物体中。对于工业生物转化过程来说，使用脂肪酶作为催化剂生产成本高，是脂肪酶工业应用过程中的瓶颈问题。
本研究从米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)中克隆了脂肪酶基因并在酿酒酵母中进行了高效异源表达。在此基础上，为降低脂肪酶工业应用中酶纯化和固定化成本，我们通过酵母表面展示和在酿酒酵母细胞内表达脂肪酶基因制备了两种不同的全细胞催化剂，为开发新型的全细胞生物催化剂作了有益的尝试。另外，本实验为了得到底物专一性脂肪酶，根据脂肪酶RML的三维结构，对酰基结合沟的氨基酸进行了定点突变，并在酵母细胞表面进行了展示表达，研究了突变点氨基酸对酶催化特性的影响，为脂肪酶的分子改构奠定了基础。
分别以R．miehei 3.4960基因组和总RNA为模板，通过PCR和RT-PCR扩增得到脂肪酶DNA碱基序列和脂肪酶cDNA碱基序列，将扩增片段经TA克隆到pMD18-T载体上，两碱基序列测序结果比对表明，脂肪酶DNA碱基序列由5个内含子和6个外显子组成，5个内含子大小分别为75bp，58bp，64bp，73bp和59bp，位于DNA序列的(以起始密码子ATG的碱基A为1)600-674位、929-986位、1076-1139位、1227-1299位、1382-1440位碱基处。脂肪酶RML mRNA碱基序列与已公布的R.miehei脂肪酶基因mRNA(EMBLAccession No．A02536)碱基序列有5个碱基的差异，其编码的氨基酸序列有1个发生了改变。
分别利用整合型表达质粒pICAS1和附加体型表达质粒pCAS，实现了脂肪酶RML基因在酿酒酵母中的分泌表达，对重组脂肪酶RML进行了相关酶学性质分析。重组菌MT8-1/pICAS1-proRML在发酵过程中，酶活逐渐积累增加，在发酵97h左右脂肪酶活达到最高值7.8U/ml。SDS-PAGE结果显示分泌表达的RML分子量为36kDa左右，说明RML基因在宿主菌中得到了有效地表达，并且分泌到培养基中。酶学性质研究表明：重组酶的最适反应温度为45℃，最适pH值为8.6；该酶偏爱中链长的酯(C8-C12)，对12个碳的酯具有最佳活性，对C16长链酯也有较高的活性，对短链酯的活性较弱；金属离子Cu2+、Fe2+对酶活性有显著抑制作用，Ca2+和Mg2+对酶活有部分的激活作用。
在酿酒酵母中实现高效分泌表达脂肪酶RML的基础上，研究了脂肪酶RML在酿酒酵母中的展示表达，实验结果表明利用α-凝集素展示系统可以实现脂肪酶RML在酿酒酵母中的高活性展示表达，重组表达菌在发酵95小时后，酶活可达到312U/l发酵液，而且大部分脂肪酶被展示在酵母细胞表面，发酵上清液中的酶活可忽略不计。我们比较了不同信号肽对脂肪酶展示表达酶活的影响，一种是利用脂肪酶RML自身信号肽，一种是利用α-因子信号肽，结果发现利用脂肪酶RML自身信号肽酵母展示表达酶活有显著提高，前者酶活约是后者的2.5倍，可能是脂肪酶RML自身信号肽更有利于酶的分泌表达。我们考察了含16个AA(RWRRSGGGGSGGGGSD)的linker肽对酵母表面展示酶活的影响，结果发现linker肽对酵母表面展示酶活的影响不明显。酵母表面展示脂肪酶酶学性质研究表明：酵母表面展示酶最适反应温度为45℃，最适pH值为8.0左右；该展示酶对8个碳的对硝基苯酚酯具有最佳活性，对C16长链酯也有较高的活性，对短链酯的活性较弱；金属离子Cu2+、Fe2+对酶活性有显著抑制作用，Ca2+和Mg2+对酶活有部分的激活作用；超低浓度表面活性剂。TritonX-100对酵母表面展示脂肪酶有显著的激活作用。除了通过细胞表面展示技术来制备脂肪酶全细胞催化剂外，我们也研究了通过在酿酒酵母细胞内异源表达脂肪酶RML来制备全细胞催化剂。这种全细胞催化剂有比较高的酶活，在未经发酵条件优化的情况下，每升发酵液可得到551个酶活单位(107U/g干细胞)。另外我们也研究了这种新型固定化脂肪酶的一些酶学性质，如底物专一性、热稳定性、pH稳定性和对短链醇的耐性等，并使用全细胞催化剂冻干粉成功地在无溶剂体系中催化合成了己酸乙酯，表明这种全细胞催化剂应用于脂肪酶催化的反应是可行的。
采用重组PCR技术对脂肪酶酰基结合沟氨基酸进行了定点突变，将位于脂肪酶RML酰基结合沟第94位的疏水性苯丙氨酸替换为亲水性甘氨酸(F94G)，获得了RML突变体，并在酵母表面展示表达脂肪酶RML突变体。把酵母表面展示表达菌株MT8-1/pICASl-proRML-mutant在SDC培养基中发酵培养后用C4、C8和C16对硝基苯酚酯测得的比酶活为8.26U/g干菌体、15.77U/g干菌体和0U/g干菌体，分别为未突变酶活性的38％、7.7％和0。用三种底物测定的脂肪酶RML突变体的比酶活都降低，用C16长链脂肪酸酯没有测到酶活，C8中链脂肪酸酯的比酶活显著降低，C4短链脂肪酸酯的比酶活降低幅度较小，结果出现了RML底物专一性显著提高。说明RML酰基结合沟第94位疏水性苯丙氨酸决定脂肪酶RML的链长专一性。