稗草(Echinochloa crusgalli(L)Beauv.)是稻田危害最严重的杂草之一。长期使用单一化学除草剂带来了抗药性稗草生物型的不断增加，加上残留药害及生态环境的破坏，使得开发稗草微生物除草剂更为迫切。为了获得更多微生物除草剂菌种资源，从浙江、安徽、江苏、广东、广西、云南、海南等不同生态条件下采集感病稗草标样分离得到尖角突脐蠕孢菌(Exserohilum monoceras(Drechsler)Leonard,简称Em)，禾长蠕孢菌(Helminthosporium gramineum Rabenh fsp.echinochloae,简称HGE)，链格孢菌(Alternariaalternata(Fr.)Keissler,简称Aa)，和弯孢菌(Curvularia lunata(Wakker)Boed.,简称C1)四个稗草病原真菌菌株。本研究目的是：①筛选一株微生物除稗剂潜力菌株，明确其生物学特性；②分离鉴定出潜力菌株HGE菌的次生代谢物；③评价HGE菌次生代谢物防治稻田有害生物的应用效果和对作物的安全性；④优化HGE菌次生代谢物的发酵条件，提高HGE菌次生代谢物产量；⑤对潜力菌株进行分子鉴定。　　 本研究比较了4株稗草病原真菌的孢子产量，菌丝体产量，杀草活性及寄主选择性，Cl菌产孢量高，但对水稻致病；Aa菌产孢量高，对水稻安全，但对稗草的致病力较低；Em菌产孢量低，对水稻安全，引起玉米轻度感病和高梁感病，但杀草活性高；HGE菌产孢量高于Em菌，对稗草致病力强，对水稻安全，只引起高梁和大麦轻度感病，选择HGE菌为微生物除稗剂潜力菌。　　 从HGE菌的菌丝体和发酵液中分离得到5种倍半萜类植物毒素，通过NMR和MS波谱分析鉴定化合物(1)-(5)分别是：3-Anhydroophiobolin B(1)，ophiobolin A(2)，3-anhydro-6-epiophiobolin A(3)，3-anhydro-6-epiophiobolin B(4)和terpestacin(5)。生测结果显示5种化合物都对稗草胚根生长有一定的抑制作用，活性从高到低依次为：ophiobolin A(2)＞terpestacin(5)＞3-anhydro-6-epiophiobolin A(3)＞3-anhydroophiobolinB(1)＞3-anhydro-6-epiophiobolin B(4)。毒素ophiobolin A对水稻胚根的生长也有一定的抑制作用，但稗草比水稻对该毒素更敏感。利用HGE菌10％粗毒素微乳剂进行稻田杂草防除试验，结果表明粗毒素对稻田杂草丁香蓼(Ludwigia prostrata Roxb.)、节节菜(Rotala indica(Willd.)Koelme)和水莎草(Juncellus serotinus(Rottb.)C.B.Clarke)有较好的防治效果，同时对稻田恶性杂草稗草(E. crusgalli(L.)Beauv.)和鸭舌草(Monochoriavaginalis(Buln.F.)Preslex Kunth)的鲜重防治效果分别达到60％和70％，而且对水稻没有明显的损伤。因此HGE菌及其代谢产物具有开发稻田杂草微生物除草剂的潜力。　　 为充分利用已有杂草生防菌菌种资源，我们进行了稗草生防菌HGE菌防治水稻病害的初步研究。菌落对峙实验结果表明HGE菌对水稻纹枯病菌丝生长有较强的抑制作用，而对稻瘟病、恶苗病菌丝生长的抑制作用稍弱。HGE菌株的发酵液对纹枯病菌的生长有较强的抑制活性，稀释5倍的发酵液24 h的抑菌率为84.1％，而对稻瘟病和恶苗病的抑制作用较低。发酵液及菌丝的乙酸乙酯提取粗毒素在200 mg/L浓度下可100％抑制纹枯病菌的生长。从粗毒素中分离纯化的有很强抑菌活性的化合物经过NMR及MS波谱分析鉴定为Ophiobolin A。Ophiobolin A在25 mg/L浓度下即可100％抑制纹枯病菌的生长，浓度1 mg/L时的抑菌率为70.2％。田间试验结果显示HGE菌粗毒素使用剂量大于500 g/ha时，对纹枯病菌的抑制作用甚至好于杀菌剂对照。然而，HGE菌发酵液不能有效控制纹枯病菌生长，而且低浓度发酵液(40 L/ha)处理还促进纹枯病生长。粗毒素处理和发酵液处理均对水稻株高、分蘖数及产量没有显著影响。在粗毒素用量为1000g/ha时，水稻产量比空白对照增加29.2％，但略低于杀菌剂对照的产量。HPLC分析结果显示所有处理的稻谷中都未检测到ophiobolin A。实验结果显示HOE菌及其代谢物Ophiobolin A具有开发水稻纹枯病生物杀菌剂的潜力。　　 本研究通过营养累加的方式分析了碳源、氮源、植物提取物等对HGE菌生产ophiobolinA的影响，优化HGE菌生产ophiobolinA的发酵条件。实验结果显示碳源、氮源和植物提取物对HGE菌生产ophiobolinA都有影响。蔗糖比较适合ophiobolinA的生产，而淀粉和乳糖不适合ophiobolin A的生产；无机氮源比有机氮源更适合HGE菌生产ophiobolinA，当以酵母粉为唯一氮源时HGE菌不能生产ophiobolinA，而NH4N03是最适宜的氮源；少量的稗草煎汁可以显著促进HGE菌生产ophiobolinA。本研究的结果还显示HGE菌在静止培养条件下能产生更多的ophiobolinA，只是静止条件下比振荡条件下培养HGE菌生长慢，毒素生产周期较长。培养基pH值对HGE菌合成ophiobolinA也有影响，起始pH值4.5-6.0比较适合ophiobolin A的生产，而碱性条件下不利于ophiobolinA的合成。最后确定的HGE菌发酵生产ophibolin A的最佳条件是：蔗糖3％，硝酸铵O.171％，KH2PO40.1％，MgSO4.7H2O0.05％，NaCl0.01％，CaCl20.01％，10％稗草煎汁，调节培养基pH值在4.5-6.0范围内，每100mL培养基中接种2块直径7mm的HGE菌块，28℃静止培养12d。可以使ophibolin A的产量由初始的小于20mg/L提高到35.69mg/L。　　 本研究应用18S rDNA和ITS作为分子标记结合形态学观察对HGE菌株99-01进行分类鉴定。99-01菌株18S、5.8S和ITS序列已提交GenBank，公告号为DQ337382。与GenBank中已提交的序列相比较，与99-01菌株的ITSl,5.8S rDNA和ITS2序列100％相似的有Bipolaris eleusines和Cochliobolus eleusines。比较发现HGE菌的l8S rDNA序列与禾旋腔孢菌属(Cochliobolus sativus)高度相似(99.9％)。采用PAUP软件分析，认为99-01菌株是Bipolaris eleusines或Cochliobolus eleusines一种。Bipolaris eleusines与Cochliobolus eleusines分别是一种菌的无性态和有性态的名称。HGE菌99-01菌株形态学观察结果是：菌株菌落生长紧密，黑色、黑褐色，气生菌丝少；孢子棕黄色至褐色，呈圆柱状或椭圆形，两端钝圆，大小17.0-21.3×62.5-102.5μm，孢子有隔，一般为2～8个隔，孢子可两端萌发产生菌丝，菌丝宽度为7.5～8.8μm。HGE形态特征与B.eleusines形态特征基本一致。HGE99-01菌株未发现有性态。因此结合18S rDNA和ITS序列分析以及形态学观察结果，我们认为HGE菌株99-01为Bipolaris eleusines。