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蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia，或称G.intestinalis，简称贾第虫)是一种厌氧的(anaerobic)原始真核原生生物，其生活史包括滋养体(trophozoite)和包囊(cyst)两个发育阶段。贾第虫滋养体缺乏线粒体，主要以糖酵解途径获取能量。以往，研究者曾在滋养体细胞裂解物内检测到磷酸烯醇式丙酮酸双激酶(Pyruvate phosphate dikinase，PPDK)和丙酮酸激酶(Pyruvate dikinase，PK)的活性，并推测二者在贾第虫的糖代谢中具有催化作用，但至今尚缺乏细胞内实验资料予以证实。
研究目的：
构建载有蓝氏贾第鞭毛虫两种代谢酶，即PPDK和PK特异性贾第虫病毒-锤头状核酶重组载体，在贾第虫细胞内对两种酶基因mRNA进行切割，阻断其基因表达，通过基因抑制前后滋养体酶活性，ATP水平检测和细胞内糖原积聚的观测结果，探讨两种酶在贾第虫糖代谢中的催化功能。
实验材料与方法：
复苏保存于液氮内的贾第虫C2株滋养体，用改良TYI-S-33培养基纯培养、传代。收获处于对数生长期的滋养体，提取基因组DNA。根据登录于GenBank中的贾第虫PPDK和PK基因序列(基因序列号分别为U43531和XM_764552)，采用RNA draw软件对它们的二级结构进行模拟分析，按照G∶C比例及锤头状核酶设计原则，设计各自的特异性锤头状核酶序列；参照文献设计合成特异性引物，通过PCR扩增得到构建载体所需的目的片段及两种核酶片段。经酶切连接将核酶片段分别载入犬贾第虫病毒载体(Giardia cania virus vector,GCV)，获得重组质粒转染载体，经体外转录得到核酶的体外转录子，而后进行细胞外切割反应和体内转染实验；用荧光实时定量PCR(real-time PCR)检测细胞外切割反应中各核酶对其靶mRNA的切割效率；用电击转染方法将构建的载体导入滋养体细胞内，检测转染后实验组和对照组各时间段靶mRNA相对含量的变化，用荧光素酶-荧光素法检测各组各时段ATP的含量变化，用紫外分光光度法检测两种酶活性，用PAS法检测糖原在虫体细胞内的积聚情况。
研究结果：
设计了蓝氏贾第鞭毛虫PPDK和PK特异性锤头状核酶序列，通过PCR扩增获得了两种核酶的cDNA片段(H5和H3)及构建载体所需要的GCV5’端的634和3’端的2174片段。将构建的载体分别命名为：pGCV634/H5/2174和pGCV634/H3/2174；PCR和双酶切鉴定和测序结果表明，载体pGCV634/H5/2174和pGCV634/H3/2174构建正确。
细胞外切割试验RNA分析结果表明，H5组(PPDK载体)中PPDK mRNA水平下降了57.1％，H3组(PK载体)PK mRNA水平下降了58.5％；载体转染滋养体细胞后的检测结果显示，H5组在转染后24h和48h PPDKmRNA的表达量分别下降到正常对照组的2％和3％，相应的酶活性各下降至正常对照组的20％和21％，ATP含量下降到正常对照组的3.8％和4.2％；H3转染组在转染后24h和48h，PKmRNA的表达量分别下降至正常对照组的5％和8％，相应的酶活性各下降至正常对照组的32％和38％，ATP含量在24h为正常对照组的81％，48h的含量出现峰值。但在转染后72h则大幅度下降。
PPDK基因阻断后糖原染色观察结果表明，各时段虫体细胞内糖原均有不同程度积聚，但以48h的水平最高，72h和96h虽也有所下降，但仍高于正常水平。表明滋养体中糖原积聚的多寡与核酶转染后PPDK表达抑制有关。
结论：
首次成功设计合成了蓝氏贾第鞭毛虫PPDK和PK特异性锤头状核酶序列H5和H3，并成功构建了蓝氏贾第鞭毛虫PPDK和PK特异性锤头状核酶-GCV重组载体pGCV634/H5/2174和pGCV634/H3/2174；两种载体在贾第虫细胞内、外对各自酶基因mRNA具有特异、高效切割活性；PPDK和PK基因mRNA被切割后，二者基因表达受到抑制，细胞内ATP水平明显降低，但PPDK核酶载体导致ATP水平降低的程度高于PK核酶载体所导致者；PPDK核酶载体导致ATP水平降低的同时伴有细胞内糖原积聚增加。上述研究结果表明，PPDK在蓝氏贾第鞭毛虫糖代谢中具有重要催化作用，但PK的功能尚需进一步研究。