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目的:以中医络病理论为指导,以高蛋氨酸饮食建立大鼠血管内皮功能障碍模型并作为参照,以力竭游泳建立过度疲劳模型,两者叠加建立复合模型,通过观察血管内皮结构与功能、肾素-血管紧张素系统、氧化应激相关指标的变化,探讨力竭游泳所致过劳对血管内皮功能的影响机制及通心络的干预作用,为研究社会心理因素在血管病变中的作用及其防治提供实验依据。方法:1.力竭游泳对血管内皮细胞结构和功能的影响将雄性Wistar大鼠随机分为4组:①正常对照组;②高同型半胱氨酸组;③力竭游泳组;④复合模型组(高同型半胱氨酸+力竭游泳)。以一般状态观察及生物学表征半定量评分、悬杆时间客观评价大鼠疲劳状态;以光镜和透射电镜技术观察主动脉形态变化、免疫组化技术检测内皮素受体(endothelin receptor,ET1)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase ,eNOS)表达、以及血液中内皮素(endothelin,ET)、一氧化氮(nitro oxygen, NO)的检测分析血管内皮功能。2.力竭游泳对肾素-血管紧张素系统的影响造模方法及动物分组同上,实验结束后采集血液标本,分别分离血浆和血清,检测血浆肾素活性(plasma renninactivity,PRA)、血浆血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)(放射免疫法);血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ,SOD)活性(羟胺法)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量(TBA法);主动脉组织中AngⅡ、AngⅡ1型受体(AngiotensinⅡreceptor, AT1R)、血管紧张素转换酶Ⅰ( angiotensin-convertion enzymeⅠ, ACEⅠ)及NADH/NADPH氧化酶亚单位p22phox的表达(免疫组化法)。3.通络干预对力竭游泳引起RAS激活及血管内皮细胞损伤的作用分为以下4组:①正常对照组;②复合模型组;③通心络组;④贝那普利组。检测指标及方法同以上两部分。探讨通心络对力竭游泳所致过劳状态下大鼠RAS的影响及血管内皮细胞的保护作用。结果:1.力竭游泳对主动脉内皮结构和功能的影响1.1主动脉内皮形态学观察结果1.1.1光镜结果正常对照组:内皮细胞完整连续,与内皮下层连接紧密,中膜、外膜均正常。高同型半胱氨酸组:内皮细胞肿胀、脱落,炎细胞附壁、浸润,内皮下层增生,平滑肌细胞肿胀。力竭游泳组:内皮细胞肿胀、分布不均匀,可见淋巴细胞附壁、浸润,内皮下层增生,平滑肌细胞紊乱。复合模型组:内皮细胞肿胀、分布不均匀,局部内皮细胞消失,内膜部分增厚、内膜内有炎细胞浸润、内弹力板有断裂;平滑肌细胞排列紊乱、水肿。1.1.2透射电镜结果正常对照组,细胞间连接紧密,细胞核及细胞器存在,线粒体结构无异常。高同型半胱氨酸组,血管内皮细胞线粒体大部分嵴和膜融合或消失,粗面内质网扩张,脱颗粒,外层核膜消失,吞饮小泡数量减少,部分核周隙扩张。力竭游泳组:血管内皮细胞线粒体大部分嵴和膜融合或消失,粗面内质网扩张,脱颗粒,外层核膜消失,吞饮小泡数量减少,部分核周隙扩张。复合模型组:血管内皮细胞线粒体大部分嵴和膜融合或消失,粗面内质网明显扩张,呈圆形或椭圆形,脱颗粒现象明显,细胞质、细胞核水肿,部分细胞膜破裂、缺失,内容物外溢。1.2.血管内皮功能相关指标的变化1.2.1 NO、ET的变化:与正常对照组比较,高同型半胱氨酸组、力竭游泳组、复合模型组各组大鼠血清中NO水平显著降低(P<0.001),血浆ET含量均明显升高(P<0.05,P<0.001)。与高同型半胱氨酸组比较,力竭游泳组NO和ET的变化无统计学差异(P>0.05),复合模型组ET明显升高,NO明显降低(P<0.05)。1.2.2主动脉组织ET1、eNOS的阳性表达正常对照组主动脉组织内皮细胞几乎未见ET1黄染阳性信号;高同型半胱氨酸组可见ET1黄染强阳性信号;eNOS黄染弱阳性信号;力竭游泳组可见ET1黄染强阳性信号和eNOS黄染弱阳性信号;复合模型组可见ET1黄染较强阳性信号,且强于高同型半胱氨酸组,几乎没有eNOS黄染阳性信号。2.力竭游泳对肾素-血管紧张素系统的影响2.1对循环型RAS的影响与正常对照组相比,高同型半胱氨酸组血浆PRA、AngⅡ有升高趋势,但无统计学差异(P>0.05);力竭游泳组、复合模型组血浆PRA、AngⅡ均显著升高(P<0.01,P<0.05);与高同型半胱氨酸组比较,复合模型组血浆中PRA、AngⅡ也明显升高(P<0.01)。2.2对组织型RAS的影响正常对照组动脉组织中未见AngⅡ、ACE、AT1R黄染阳性信号;高同型半胱氨酸组AngⅡ、ACE、AT1R被诱导表达,于动脉组织细胞的胞质中可见黄染信号;力竭游泳组动脉组织中可见AngⅡ、ACE、AT1R阳性黄染信号;复合模型组动脉组织中可见AngⅡ、ACE、AT1R较强阳性黄染信号。2.3 SOD、MDA,p22phox的变化与正常对照组比较,高同型半胱氨酸组、力竭游泳组、复合模型组MDA水平均明显升高(P<0.05,P<0.01),血清SOD活性均显著降低(P<0.05,P<0.01),p22phox阳性表达均不同程度增强,以复合模型组阳性表达最强。3.通络干预对力竭游泳引起RAS激活及血管内皮损伤的作用3.1.通心络对力竭游泳引起的内皮损伤的改善作用3.1.1通心络对力竭游泳引起的内皮形态变化的作用①光镜结果正常对照组:内皮细胞完整连续,与内皮下层连接紧密,中膜、外膜均正常;复合模型组:内皮细胞肿胀、分布不均匀,局部内皮细胞消失,内膜部分增厚、内膜内有炎细胞浸润、内弹力板有断裂;平滑肌细胞排列紊乱、水肿。两用药组:内皮细胞肿胀、脱落程度及内膜嗜伊红物质增生程度均较复合模型组明显减轻,通心络与贝那普利作用相当。②透射电镜结果正常对照组:内皮细胞间连接紧密,细胞核及细胞器存在,线粒体结构无异常。复合模型组:内皮细胞线粒体大部分嵴和膜融合或消失,粗面内质网扩张,呈圆形或椭圆形,脱颗粒现象明显,细胞质、细胞核水肿,部分细胞膜破裂、缺失,内容物外溢。两用药组:较复合模型组均明显减轻,通心络与贝那普利改善作用相当。3.1.2通心络对力竭游泳引起的内皮功能改变的作用①对NO、ET含量的影响与正常对照组比较,复合模型组NO水平显著降低(P<0.01),ET含量明显升高(P<0.01);与复合模型组比较,通心络组NO水平显著升高(P<0.001);而贝纳普利组NO变化无统计学差异(P>0.05);较无统计学差异(P>0.05)。②对主动脉组织中ET1、eNOS表达的影响ET1:正常对照组主动脉内皮细胞ET1微弱阳性表达;复合模型组ET1强阳性表达。与复合模型组相比,各用药组ET1呈微弱阳性表达。eNOS:正常对照组主动脉内皮细胞eNOS呈强阳性表达;复合模型组几乎没有eNOS表达,两用药组可见eNOS呈阳性表达,其黄染信号强度较复合模型组增强。3.2通心络对RAS的影响3.2.1通心络对循环型RAS的影响与正常对照组比较,复合模型组血浆PRA、AngⅡ均升高(P<0.01,P<0.05);与复合模型组相比,通心络组PRA、AngⅡ水平显著降低(P<0.05,P<0.001);贝那普利组AngⅡ水平显著降低(P<0.01)。3.2.2通心络对组织型RAS的影响正常对照组大鼠主动脉组织内皮细胞几乎未见AngⅡ、ACE、AT1R黄染阳性信号;复合模型可见AngⅡ、ACE、AT1R阳性黄染信号,内膜下增厚处可见ATR-1弱阳性黄染信号;与复合模型组比较,通心络组可见AngⅡ、ACE、AT1R弱阳性黄染信号,贝那普利组可见ACE、AT1R的弱阳性信号。3.2.3通心络对SOD、MDA、p22phox变化的影响①SOD、MDA的变化与正常对照组比较,复合模型组MDA含量显著升高,SOD活性均显著降低(P<0.01);与复合模型组比较,两用药组MDA含量降低, SOD活性升高(P<0.05)。以通心络组效果显著(P<0.05)。②p22phox的变化正常对照组主动脉组织未见p22phox黄染阳性信号,复合模型组可见p22phox较强黄染阳性信号,两用药组可见p22phox黄染弱阳性信号,并且以通心络组变化明显。结论:1.本研究以过劳等社会心理因素在血管病变发生发展中的影响为背景,以高蛋氨酸饮食喂养大鼠造成血管内皮损伤为参照,探讨力竭游泳所致过劳对血管内皮结构与功能的影响,结果表明单纯力竭游泳可使大鼠血管内皮细胞结构和功能出现明显损伤,显示力竭游泳所致过劳是引起血管内皮损伤的重要危险因素,力竭游泳与高蛋氨酸饮食叠加时可加重高蛋氨酸所致大鼠血管内皮损伤。2.探讨力竭游泳对大鼠循环型RAS及组织型RAS的影响,发现力竭游泳可以激活大鼠循环型RAS,但对局部动脉组织中的RAS影响不明显;高蛋氨酸饮食可使大鼠局部组织RAS激活,对循环型RAS影响不明显;复合模型大鼠循环型和组织型的RAS均激活。揭示了力竭游泳可诱发大鼠循环型RAS过度激活并加重高蛋氨酸饮食引起的大鼠局部RAS激活。3.力竭游泳引起模型大鼠RAS激活的同时氧化-抗氧化平衡失调,这种变化在复合模型中进一步加重,提示力竭游相关,这可能是力竭游泳所致过劳引起血管内皮损伤的机制之一。4.通心络可通过降低复合模型大鼠血浆中PRA、AngⅡ水平抑制循环型RAS过度激活,而贝那普利对循环型PRA升高的影响不明显,同时通心络还能抑制组织型RAS的过度激活,进而抑制RAS激活产生的自氧化作用,改善血管内皮结构和功能。