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背景及目的: 口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是头颈部肿瘤中常见的恶性肿瘤之一,由于口腔颌面部口腔、鼻腔等腔隙的存在,血液供给及淋巴管道丰富,口腔鳞状细胞癌浸润速度较快,肿瘤细胞容易向远处转移,最终使得口腔癌的预后较差、生存率较低,OSCC患者的5年生存率只有 50%左右,因此,探讨 OSCC 预防、治疗及预后评估有着非常重要的意义。 研究表明,上皮-间充质转化(epithelial to mesenchymal transitions ,EMT)与恶性肿瘤的早期浸润晚期的远处转移关系密切,Greenbwg和Hay早在1982年就提出EMT的概念,即在某种特定情况下,肿瘤上皮细胞形态、特性等会发生改变,如上皮细胞会失去其静止的特性而获得间质细胞移动的能力。肿瘤转移的过程中EMT的发生使得肿瘤细胞从原发部位分离脱落并随血管、淋巴管等转移至不同位置继续发展,EMT的过程是受多种细胞因子和转录因子调控,如Slug作为重要的转录因子参与其中,本文通过对口腔鳞癌Tca8113细胞转染Slug过表达质粒,观察EMT相关标志物Vimentin和E-cadherin的表达,研究Slug过表达对口腔鳞癌Tca8113细胞侵袭能力的影响,阐明其相关机制,从而为日后口腔鳞状细胞癌的靶向治疗提供理论和实验依据。 方法: 选口腔鳞状细胞癌细胞系Tca8113细胞为实验对象,构建带有使Slug基因过表达的质粒载体,将口腔鳞癌Tca8113接种于6孔板,温箱培养24h细胞贴壁汇合度达到 80%-90%时,可用 lipofectamine6000 转染质粒,将细胞分为三组: ①空白对照组即 Control 组,此组细胞不加质粒载体; ②转染目的质粒组,即GV141/Slug载体组; ③转染空载体组,即GV141组。将三组细胞培养24h后,荧光显微镜下观察细胞内有无荧光表达,并应用实时荧光定量 PCR和蛋白免疫印迹法检测 Slug 基因和蛋白的表达情况以鉴定转染效能,然后用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法继续检测EMT相关的E-cadherin和Vimentin基因mRNA和蛋白的表达情况。划痕实验和Transwell实验检测三组细胞转移和侵袭能力的区别。应用SPSS19.0统计软件对数据进行统计处理,数据用均数±标准差((?x) ±s)表示,使用两样本均数t检验法,组间数据采用单因素方差分析,α = 0.05为检验标准,以P<0.05为差异具有统计学意义。 结果: 1. 转染效能鉴定: 1) ①空白对照组即 Control组,此组细胞不加质粒载体;②转染目的质粒组,即GV141/Slug载体组;③转染空载体组,即GV141组。将三组细胞培养24h后,荧光显微镜下观察可见第二、三组均可见绿色荧光。 2) 实时荧光定量PCR检测三组细胞中Slug基因mRNA表达情况::GV141空载组相对于Control组的Slug mRNA表达量为(0.263±0.390,P=0.363),差异无统计学意义。GV141/Slug相对于GV141组的Slug mRNA表达量为(7.907±0.741,P=0.003),即GV141/Slug组Slug mRNA的表达量高于GV141组具有统计学意义。 3) 蛋白免疫印迹法检测三组细胞中Slug蛋白的表达情况:GV141组较Control组 Slug 蛋白相对表达量为(0.024±0.05,P=0.492),差异无统计学意义。GV141/Slug 组细胞较 GV141 组细胞 Slug 蛋白相对表达量(0.371±0.106, P=0.026),具有统计学意义。 2. 实时荧光定量PCR检测三组细胞中EMT相关的E-cadherin和Vimentin 基因表达量结果显示:GV141组细胞相对Control组的E-cadherin mRNA表达量为(0.139±0.427,P=0.631),差异无统计学意义。GV141/Slug 组细胞相对于GV141组细胞的E-cadherin mRNA表达量为(-0.837±0.307,P=0.042),差异有统计学意义。GV141组细胞相对Control组的Vimentin mRNA表达量为(0.129±0.603,P=0.746),差异无统计学意义。GV141/Slug相对于GV141组细胞Vimentin mRNA表达量为(5.556±1.734,P=0.031),差异有统计学意义。 3.蛋白印迹Western blot检测三组细胞中EMT相关E-cadherin和Vimentin蛋白表达量,结果显示:GV141 组较 Control 组 E-cadherin 蛋白相对表达量(0.002±0.029,P=0.902),差异无统计学意义。GV141/Slug组较GV141组E-cadherin蛋白表达量为(-0.217±0.043,P=0.013),说明GV141/Slug组细胞 E-cadherin蛋白表达量高于 GV141 组细胞具有统计学意义。GV141 组较Control组Vimentin蛋白相对表达量为(0.007±0.069,P=0.882),差异无统计学意义。GV141/Slug组较GV141组Vimentin蛋白表达量为(0.343±0.095, P=0.025),差异具有统计学意义。 4. 划痕实验:GV141组细胞在24h愈合距离较Control组细胞为(-0.772±1.345, P=0.463),差异无统计学意义。GV141/Slug 组细胞在 24h 后的愈合距离较GV141组细胞为(28.235±1.562,P=0.001)具有明显统计学意义。 5. Transwell 实验:GV141/Slug 组细胞 24h 穿过小室的细胞数较 GV141 组和Control组细胞多,GV141组细胞24h穿过小室的细胞数较Control组细胞为(-0.333±8.386,P=0.951),差异无统计学意义。GV141/Slug组细胞24h穿过小室的细胞数较GV141组细胞为(38.33±14.045,P=0.042)具有统计学意义。 结论: 在口腔鳞癌细胞系Tca8113 细胞中,构建带有使Slug过表达质粒和空载体质粒 ,并将其分别转染Tca8113细胞,结果发现转染Slug基因过表达的质粒的细胞组其Slug和Vimentin基因mRNA和蛋白表达量较其余两组增加,而其E-cadherin基因的mRNA和蛋白的表达量较其余两组有所下调,另外,GV141/Slug组细胞转移、侵袭能力较其余两组有所增强。由此可说明Slug基因过表达可促使EMT的发生,并且在Tca8113 细胞中Slug基因可通过抑制E-cadherin基因的表达从而影响细胞转移、侵袭的能力。