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研究背景镉(Cadmium)是自然环境和职业环境中常见毒物之一,其污染源主要来自于食物链传递和工业应用,并且可通过非职业和职业暴露危害人群健康。骨是镉重要的靶点,由于镉能在体内蓄积并且生物半衰期很长,即使是低剂量持续暴露也会引起骨损伤。间充质干细胞(MSCs)是一种具有自我增殖能力的非造血干细胞,可以分化为成骨细胞。研究表明镉可以通过影响间充质干细胞活力从而抑制骨形成和影响骨组织的健康。自噬是一种在进化上高度保守的,并可通过清除有害组织器官和细胞内有毒大分子物质维持细胞稳态的分解代谢途径。然而,自噬也可以通过激活凋亡和抑制胞质内容物非特异性降解从而导致细胞死亡。哺乳动物O类叉形头转录因子(FOXOs)有很多生物学功能,大量研究发现FOXO3a可能参与了自噬诱导过程,包括自噬小体形成和自噬相关基因表达。同时,AMPK可通过磷酸化FOXO3a特异性位点,增强其转录活性。因此,本课题研究的主要目的是探讨镉是否引起间充质干细胞死亡及阐述其潜在机制。研究内容1.为了研究镉暴露是否引起间充质干细胞自噬性死亡,将间充质干细胞用不同浓度氯化镉(CdCl2)处理24h,或用14μM浓度Cd Cl2分别处理0,6,12,24h,构建实验模型。利用CCK-8实验评估镉暴露后细胞活力情况,并采用台盼蓝实验评估细胞死亡情况。通过共聚焦激光扫描显微术评估镉暴露后自噬小体形成情况,并用自噬抑制剂氯醛(chloroquine,CQ)检测镉暴露对自噬流的影响。在了解了自噬流变化的基础上,我们进一步测定了镉暴露后自噬相关基因表达情况。最后,通过抑制自噬关键基因BECN1表达及运用自噬抑制剂3-MA的实验方法明确抑制自噬过程能否逆转镉暴露引起的间充质干细胞自噬性死亡。2.为进一步研究镉暴露引起间充质干细胞死亡的具体机制,我们首先运用蛋白印迹(Western blot,WB)、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)和免疫荧光(immunofluorescence)技术测定了FOXO家族成员分子的表达情况并同时测定了上游分子AMPK的表达情况。然后,在明确相关分子表达的情况下,运用基因沉默技术及AMPK特异性抑制剂化合物C(Compound C,CC)处理进一步探讨AMPK-FOXO3a信号通路是否参与了镉引起的间充质干细胞自噬性死亡。研究结果1.镉暴露降低了间充质干细胞细胞活力并增加了细胞死亡数量,呈现时间-剂量依赖关系。镉处理引起GFP标记的LC3小点增加,氯醛预处理进一步加剧了镉造成的自噬流改变。再者,镉暴露引起自噬相关基因包括BECN1,ULK1,ATG5和ATG12m RNA表达水平明显增高,并呈时间和剂量依赖性。但是,只有BECN1蛋白表达水平和上述基因水平一致。进一步干扰BECN1基因表达和运用自噬抑制剂3-MA可以明显减轻镉造成的间充质干细胞死亡。2.镉暴露后,FOXO1和FOXO3a基因和蛋白表达水平明显增加,但是只有FOXO3a发生了明显的核转位。此外,镉暴露可明显增强FOXO3a转录水平,而对FOXO1无明显影响。我们进一步发现镉暴露可以升高FOXO3a丝氨酸588位点和AMPK苏氨酸172位点磷酸化水平,并呈剂量依赖关系。抑制AMPK基因表达或运用AMPK特异性抑制剂化合物C处理可显著降低镉暴露引起的FOXO3a丝氨酸588位点磷酸化水平改变。最后,我们发现抑制FOXO3a基因表达可明显减轻镉诱导的BECN1和LC3表达及自噬小体形成情况。此外,运用FOXO1和FOXO3a si RNA均能在一定程度上逆转镉暴露引起的间充质干细胞死亡。研究结论根据实验研究结果,可以得出以下结论:1.镉暴露通过引起间充质干细胞自噬相关基因表达及自噬小体生成诱导发生自噬,抑制自噬关键基因BECN1的表达可以减轻镉暴露引起的细胞死亡。2.镉暴露可以增强间充质干细胞FOXO3a和FOXO1表达。同时,镉暴露增加AMPK表达水平,并通过磷酸化FOXO3a特异性位点(丝氨酸588位点)进一步促进FOXO3a发生核转位并增加其转录水平。抑制FOXO3a基因表达可显著地减少镉诱导的自噬相关基因表达和自噬小体生成,从而进一步改善镉引起的间充质干细胞死亡,而抑制FOXO1基因表达则没有明显的上述效应。