【摘 要】
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人载脂蛋白AI米兰变体(Apo AI)是第一例报道的人载脂蛋白的变体.其突变位点在173位精氨酸(Arg)变为半胱氨酸(Cys),从而蛋白能形成二聚体形式.同时Arg→Cys明显改变了Apo AI蛋
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人载脂蛋白AI米兰变体(Apo AI<,M>)是第一例报道的人载脂蛋白的变体.其突变位点在173位精氨酸(Arg)变为半胱氨酸(Cys),从而蛋白能形成二聚体形式.同时Arg<173>→Cys明显改变了Apo AI蛋白的空间结构和脂结合特性.由于突变位点位于一个α螺旋内,使得内部螺旋的结合更加方便,从而二聚体的ApoAI<,M>比ApoAI单体含有更多的α螺旋结构.然而同ApoAI一样,ApoAI<,M>对应mRNA和蛋白质在大肠杆菌中的不稳定性,所以利用重组大肠杆菌表达成熟Apo AI<,M>比较困难.相比之下原蛋白Proapo AI在利用大肠杆菌表达时表现了比较好的稳定性.在本研究中,一个带有P<,R>P<,L>启动子的载体pBV220被用来表达ProapoAI<,M>蛋白.为了方便Milano位点的突变,整段Proapo AI<,M>分成两段通过RT-PCR来合成,同时通过对上游基因进行优化来提高蛋白的表达量.同时通过点突变在Proapo AI<,M>氨基端产生一个酸水解位点,从而方便去除前面的6肽原片断.Proapo AI<,M>蛋白在合成培养基上通过菌体高密度培养进行生产.宿主菌的选择、培养基的优化和培养条件的优化在本文做了研究.主要是一种新的诱导方法-二次升温诱导在这里做了详细研究,并且被证明能大大提高蛋白的表达量.此外,通过流加培养基中C/N比优化和葡萄糖限制培养,可以减弱培养基中乙酸和铵根离子对目的基因表达的影响.最后,根据优化的条件进行实验,菌体密度能达到150,Proapo AI<,M>产量能达到7.59g/L,这是目前文献报道该蛋白表达量最高的结果.
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