酿酒酵母是最简单的真核生物,是研究细胞周期及调控的理想模式生物。DNA的复制起始是细胞周期的重要事件,DNA复制一旦起始将不可逆的进行下去。DNA复制起始不仅是一个基本的生物学问题,并且为癌症的研究提供新的角度和依据。酿酒酵母的DNA复制起始需要复制起始序列ARS(autonomously replicating sequence)和复制起始蛋白以及其他细胞周期调控蛋白的共同作用。这些DNA复制起始蛋白以及调控蛋白的发现和功能研究帮助我们更好的理解DNA的复制过程,但是DNA复制起始的详细机制仍不完全清楚,新的DNA复制起始蛋白需要我们去发现并研究其具体功能。　　 酿酒酵母Cdc48p属于AAA+ATPases家族蛋白(ATPase associated with diversecellular activities),参与细胞膜融合,泛素依赖的蛋白降解途径和有丝分裂等重要的生物学过程。我们实验室在研究中发现CDC48是DNA复制起始蛋白突变菌株orc4-2的多拷贝校正子,并与复制起始蛋白ORC和MCM有物理的相互作用,CDC48的突变细胞cdc48—3的DNA复制起始有缺陷,表明Cdc48p可能是复制前复合物(pre-replicationcomplex；pre-RC)的一个组成蛋白或是调控蛋白。但是由于Cdc48p也参与了有丝分裂的完成过程,我们无法在正常细胞周期中研究Cdc48p对复制前复合物的形成等DNA复制起始关键步骤的影响。在DNA重复复制系统(re-replication system)中,通过N端敲除的Sic1(Sci1ΔNT)的过表达及其随后的降解,细胞在有丝分裂之前重复复制基因组DNA。我们利用DNA重复复制系统研究了Cdc48p在DNA复制起始中的功能,发现Cdc48p功能缺失,细胞不能起始DNA的复制,但是复制前复合物可以形成。Cdc48p功能缺失引起的DNA复制缺陷不依赖Far1p,不影响Sic1△NT的表达和降解。如果在Cdc48p有活性的情况下先使复制前复合物形成,再失活Cdc48p,细胞可以完成DNA的复制。说明Cdc48p大体上不影响复制前复合物的形成,但是影响了复制前复合物的活性。　　 我们在研究中还发现Cdc48p影响了MCM蛋白在G2/M期的定位。由于Cdc48p参与泛素依赖的蛋白降解途径,我们尝试寻找Cdc48p的作用底物从而阐明Cdc48p在DNA复制起始中的作用机理。　　 另一个可能参与DNA复制起始的蛋白Rts2p,其在哺乳动物中的同源蛋白参与DNA的复制。我们构建了rts2-td温度敏感菌株,FACS分析发现Rts2p在酵母中也影响DNA的复制。我们可以利用酿酒酵母遗传操作方便等优点,对Rts2p在DNA复制中的具体机制进行深入研究。　　 为找到更多新的参与DNA复制起始的蛋白,我们实验室设计了一种新的遗传筛选方法:IDR(initiation of DNA replication)筛选。IDR筛选是一种高度灵敏的筛选DNA复制起始蛋白的方法,我们期望通过IDR筛选找到大部分参与DNA复制起始的蛋白。在本论文研究中我们共对33,598个菌株进行了筛选,通过初级筛选,二级筛选,三级筛选等步骤共得到14个idr候选菌株。我们通过对idr候选菌株进行文库筛选,鉴定其中两个idr候选菌株为CHL1基因突变。剩余的12个idr候选菌株有待鉴定。