论文部分内容阅读
胸腺素α原是一种在体内广泛表达的小分子量强酸性蛋白质,进化上高度保守,分布极其广泛,淋巴组织及非淋巴组织均可找到,其相对分子质量为12.5k,基因定位于第2号染色体上。它除了具有促进机体免疫功能外,另一个重要功能是提高细胞的增殖能力,是细胞生长和存活不可缺少的;缺乏ProTα的细胞不能分裂。由于ProTα与细胞增殖相关,而肿瘤细胞具有强烈的增殖活性,因而ProTα在肿瘤进展中的作用成为研究焦点。ProTα参与肿瘤发生、细胞凋亡及转录调节。目前的研究主要集中于ProTα基因的调节机制及其在肿瘤诊断和治疗中的价值。
由于ProTα无二级结构,免疫原性差,很难制备出对它的单克隆抗体,本研究分别采用ProTα与小分子载体蛋白KLH偶联的方法,和运用常规基因工程手段获得GST-ProTα融合蛋白,增强ProTα的免疫原性,制备出较高效价的大鼠抗ProTα的多克隆抗体、小鼠抗ProTα的多克隆抗体和兔抗ProTα的多克隆抗体,之后采用细胞荧光免疫组化、石蜡切片免疫组化、斑点杂交、Western-Blot等方法,将这些抗体应用于正常增殖的细胞、肿瘤细胞、组织蛋白、人体尿液、病理切片等的免疫亲和反应检测,初步探讨ProTα与细胞增殖的关系和在肿瘤组织中的表达,以及ProTα作为泌尿系统肿瘤标记物的可行性。
结果显示,制备出的多克隆抗体效价较高,与抗原蛋白能产生较强的特异性结合。通过对处于分裂状态下的非肿瘤细胞(包括小鼠淋巴结细胞,肾小管细胞)的检测发现,这些分裂的细胞均被检测有ProTα高表达,并且集中在细胞核内。以标准品ProTα做阳性对照对膀胱肿瘤、肾肿瘤和前列腺癌患者尿液检测,均能够特异性检测到其中的ProTα,肿瘤病人尿液的检出率为100%,并且发现晚期病人样品反应强度比早期患者明显增强,术前病人样品明显比术后病人样品反应强。泌尿系统炎症等疾病尿液检出率为53.8%,正常人只有9%,且显示斑点明显微弱,检测下限为1ng/μL。作为一种筛选手段,敏感性和阴性预测比特异性更重要,也就是说减少漏诊率,因此,本实验对于将ProTα作为肿瘤标记物的进一步研究具有重要意义。
斑点杂交方法检测尿液中的ProTα具有试剂用量少;操作简便快速,不需要特殊设备条件;无创伤无痛苦;检测结果可长期保存,便于复查;特异性强,敏感性高等特点。这对研究ProTα的生物作用机制、研究有效简便的肿瘤标记物试剂盒具有重要的理论意义和应用价值。