磁性纳米粒子（Magnetic nanoparticles,MNPs）是近些年固定化酶载体材料研究的热点之一。传统的共价固定化方法是将酶的氨基酸残基作为固定化位点与表面功能化修饰后的MNPs进行连接。这种方法在酶固定化位点选择上具有随机性,会在很大程度上增加固定化酶实验结果的不确定性,从而导致固定化效果难以把控。因此,非常有必要对定向固定化酶进行研究,开发出操作简单和可行性高的定向固定化方法。与游离酶相比,固定化酶除了具有稳定性高、容易分离、可重复利用等优点外,还被报道用于配体垂钓（Ligand fishing）,这是一种特异性识别和筛选酶活性配体的新方法。茶皂素（Tea saponins,TSs）是一种三萜类皂苷,具有抑制乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase,ADH）活性的作用。但令人烦恼的是TSs是一类混合物,仅山茶属（Camellia）植物中就被报道有近200种分子结构不同的茶皂素单体,不同单体之间的结构和极性相似,活性却差别很大,这使得TSs活性单体的分离纯化及结构鉴定工作变得十分困难。在此背景下,本文利用蛋白质生物信息学和3D可视化软件VMD分析出ADH的最佳固定化位点,将其定向固定到表面经氨基化修饰的MNPs材料上,并将得到的固定化酶（Immobilized alcohol dehydrogenase,IADH）应用于TSs中ADH活性配体的磁性垂钓。主要研究内容及结果如下:（1）表面氨基化修饰的磁性纳米粒子AMNPs的制备与表征。用水热/溶剂热法制备出粒径为105.13±4.67 nm的MNPs,然后包裹上Si O2外壳,再利用APTES修饰上氨基后得到AMNPs。FT-IR图谱显示,AMNPs有Fe-O键、Si-O键和N-H的特征吸收峰,说明AMNPs制备成功,可作为后续固定化ADH的载体材料;Zeta电位值由修饰前的7.81±0.10 m V（MNPs）升高为修饰后的40.37±0.45 m V（AMNPs）,电位的增加也佐证了MNPs氨基功能化修饰成功。通过SEM和TEM观察到MNPs的微观形貌粒径均匀、分散性良好,包裹在外表面的Si O2厚度在15 nm左右,DLS、SEM和TEM三者得到的结果相一致。（2）最佳固定化位点的确定及定向固定乙醇脱氢酶。通过蛋白质生物信息学和3D可视化软件VMD分析了可作为ADH固定化位点的8种活性氨基酸残基（羟基、羧基、氨基、苯基、咪唑基、巯基、胍基和吲哚基）在酶分子中的数量占比和空间分布。结果显示ADH分子中游离的ε-NH2集中分布在酶结构的外表面,远离ADH的活性Zn2+催化中心,且在数量上也占比适中,为10.37%,符合固定化位点的条件,被选定为固定ADH的最佳的活性基团。在此基础上,选择两种不同的固定化位点进行实验验证。结果表明通过游离的ε-NH2反应得到的固定化酶IADH相对酶活为（65.53±1.31）%,而通过游离的ε-COOH反应得到的IADH相对酶活为（45.35±3.73）%,前者是后者的1.45倍。实验结果与理论分析相一致,证明可以通过酶的生物信息学分析来指导酶的定向固定化实验。（3）固定化乙醇脱氢酶IADH的性能研究。IADH的最适催化p H为8.8,与FADH保持一致;最适催化温度为30℃,比FADH升高了5℃。测得IADH米氏常数Km为41.23 mmol/L,活化能Ea为17.58 KJ/mol,与FADH相差不大。但固定化后显著提高了IADH的p H稳定性、热稳定性和储藏稳定性。在p H 10.0中处理60 min后,IADH的相对酶活是游离酶FADH的1.58倍;在55℃中处理60 min后,IADH的相对酶活是FADH的4.43倍;在25℃的储藏环境下,FADH在第5 d酶活就降为0,而IADH在第10 d仍保留有（10.07±0.11）%的相对酶活。VSM证实IADH具有超顺磁性,饱和磁矩为34.54 emu/g,连续使用10个批次后,IADH仍保留有（46.88±2.70）%的相对酶活,可以实现快速磁性分离和循环再利用。（4）IADH应用于茶皂素中活性配体LTs的磁性垂钓及LTSs与ADH的相互作用研究。利用LC-TOF-MS/MS对磁性垂钓出的LTSs进行分析,得到3种结构的茶皂素单体,确定其中的2种分子式均为C59H92O26,并给出了其可能的分子结构。LTSs对ADH的活性有抑制作用,抑制类型为混合型,测得IC50为4.97×10-5 mol/L。荧光光谱学实验表明,25℃下,LTSs与ADH相互作用会使ADH产生静态的荧光猝灭,猝灭常数KSV为6.17×10~3L/mol,结合常数Kb为2.26×10~3L/mol,结合位点数n接近1。热力学参数（ΔSθ>0,ΔGθ<0）表明LTSs与ADH的结合是熵驱动的自发过程,三维荧光实验证实两者相互作用会导致ADH构象发生变化,这可能是ADH酶活降低的原因。