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目的:研究Pin1在肿瘤细胞中的作用,验证抑癌蛋白G0S2是Pin1作用的靶基因,Pin1通过调节G0S2的表达,从而对白血病的发生发展起调节作用;探讨Pin1调节G0S2对白血病细胞生物学特性的影响,及其分子机制。方法:(1)构建Pin1敲除的CRISPR-Cas9质粒,转染HEK-293T细胞株,构建Pin1敲除的细胞。(2)通过Real-time PCR进行筛查Pin1敲除后与细胞周期、增殖及迁移相关基因mRNA表达的改变情况,筛选对Pin1敲除敏感的基因。(3)观察利用shRNA敲减Pin1以及ATRA抑制Pin1蛋白活性后对白血病细胞株HL-60、NB4细胞生物学的影响:MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期与凋亡等;Western Blot检测Pin1敲减及G0S2过表达后相关基因的改变。结果:(1)Pin1敲除的HEK-293T细胞株细胞增殖能力等相对于正常的HEK-293T细胞来说,受到显著的影响:a.利用CRISPR-Cas9技术成功构建了Pin1敲除的HEK-293T细胞,基因组测序结果显示,其基因组分别丢失了18和30个碱基;b.细胞增殖以及细胞形态发生了显著的变化;c.Real-time PCR结果显示G0S2等相关基因在Pin1敲除后显著上调;ZEB1等基因显著下调;d.Western Blot结果提示,Pin1敲除后,Cyclin D1、CDK6等蛋白下调;e.回复Pin1后,G0S2表达下调。(2)在急性粒细胞白血病(APL)细胞中敲减Pin1及Pin1特异性抑制剂—ATRA作用后,G0S2显著上调,细胞增殖、凋亡、周期等显著变化:a.在APL细胞中沉默Pin1后,检测到G0S2 mRNA的表达水平显著增加;b.Pin1特异性抑制剂—ATRA作用于APL细胞后,Pin1蛋白显著下调,mRNA并未有明显变化,而G0S2 mRNA及蛋白表达均有所增加;c.ATRA作用后,APL细胞的增殖能力受到显著抑制,细胞周期被阻滞于G0/G1期且PE-Annexin检测细胞凋亡率发现其增加约20%,TUNEL染色均显示细胞凋亡显著增加;d.在肝癌细胞中Pin1敲减与ATRA处理均能使Pin1下调,G0S2上调,并且导致细胞凋亡率的增加。结论:(1)利用CRISPR-Cas9技术构建的Pin1敲除HEK-293T细胞成功,Pin1敲除以后G0S2,ZEB1等基因mRNA表达水平发生显著变化;(2)Pin1敲减及ATRA处理APL细胞均发现G0S2的表达水平均发生显著上调,并且细胞增殖、周期等均显著受到影响。由此得出结论:Pin1调节G0S2的表达,促进APL的发生。