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目的：
通过检测慢性肝病不同阶段患者的血清25羟基维生素D(25.hydroxyvitaminD,25OHD)水平,了解这类患者的维生素D状态,并探讨维生素D水平与肝脏疾病严重程度的关系;通过检测肝硬化腹水患者腹腔白细胞维生素D受体(vitaminDreceptor,VDR)及LL-37(人抗菌肽)的表达水平,探讨是否维生素D-抗菌肽通路参与自发性细菌性腹膜炎(spontaneousbacterialperitonitis,SBP)的发病机制:通过检测腹腔巨噬细胞经维生素D干预前后其VDR及LL-37水平变化情况,明确维生素D对腹腔巨噬细胞LL-37应答的调控,探讨维生素D是否可增强腹腔局部的抗菌免疫功能。
材料与方法：
一、实验材料:
1、研究对象:
选择2011年4月至2011年12月期间于中国医科大学附属盛京医院第二感染性疾病、肝病病房住院治疗的183例慢性肝炎或肝硬化患者为研究对象。所有患者均行肝脏生化学、免疫学、病毒学及肾功能、凝血机制检测,肝硬化腹水患者入院后行诊断性腹腔穿刺术检测,行肝脏影像学检查,并记录病例人口学及病因学特点。
慢性乙型肝炎诊断标准参照《慢性乙型肝炎防治指南》、慢性丙型肝炎诊断标准参照《丙型肝炎防治指南》、肝硬化诊断标准参考《病毒性肝炎防治方案》、SBP诊断标准参照美国肝病研究协会制定的指南。
排除标准:6个月内曾补充过维生素D治疗的全部慢性肝病患者;SBP发生前1个月内应用过口服选择性肠道杀菌剂诺氟沙星或其他抗生素、或腹腔穿刺术前2周内应用抗生素治疗的肝硬化腹水患者。
2、主要试剂:
1,2,5(OH)2D3、LPS(055:B5)(Sigma,St.Louis,MO,USA)
RNAisoPlusTMRNA提取试剂盒、PrimeSciptTM逆转录试剂盒、SYBR(R)PremixExTaqTM实时定量PCR试剂盒(宝生物工程有限公司,大连,中国)
VDRcDNA引物序列F:5-GACCTGGTCAGTTACAGCATCCAA-3R:5-TCAGCAGTACGATCTGGTCCTCA-3
LL-37cDNA引物序列F:5-GACACGCCAAAGCCTGTGAG-3R:5-LTCACCCAGCAGGGCAAATC-3GAPDHcDNA引物序列F:5‘-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3R:5-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3
兔抗人LL-37抗体、小鼠抗人VDR抗体、小鼠抗人β-Actin抗体(SantaCruz,SantaCruz,CA,USA)
HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗小鼠IgG、FITC标记山羊抗兔IgG、罗丹明标记山羊抗小鼠IgG(中杉金桥生物技术有限公司,北京,中国)
PE标记小鼠抗人CD11b抗体、FITC标记小鼠抗人CDl4抗体(四正柏生物科技有限公司,北京,中国)
25-羟基维生素D检测试剂盒(IDS,FountainHills,AZ,USA)
人LL-37ELISA检测试剂盒(HyCult,Uden,Netherlands)
二、实验方法:
1、慢性肝病严重程度判断:
慢性肝炎病变程度判断:参考《病毒性肝炎防治方案》,将慢性肝炎病例分为轻度、中度和重度。
肝硬化肝脏损害严重程度评估:参考Child-Pugh评分标准,肝硬化患者分为Child-PughA级、B级和C级;同时进行终术期肝病疾病模型(modelofend-stageliverdisease,MELD)评分。
2、维生素D状态参考标准:
根据慢性肝病患者血清25OHD浓度,将其划分为维生素D充足、缺乏和不足。
3、血清及腹水上清250HD浓度测定:
ELISA方法。
4、腹腔白细胞收集:
离心腹水,收集下层白细胞团块。
5、腹腔巨噬细胞分离纯化及纯度鉴定:
将腹腔白细胞贴壁培养2小时,去除未贴壁细胞,剩余细胞为腹腔巨噬细胞。并经流式细胞仪检验CD11b+CD14+双阳性细胞为巨噬细胞。
6、腹腔巨噬细胞培养及药物干预:
将腹腔巨噬细胞于含5%胎牛血清的无酚红DMEM培养基中培养,分别给予不同浓度LPS、1,25(OH)2D3,并孵育不同时间,选择药物最适作用浓度及作用时间;将巨噬细胞与LPS及1,25(OH)2D3共同孵育,检测1,25(OH)2D3对腹腔巨噬细胞抗菌肽应答的调控。
7、巨噬细胞VDR及LL-37的表达:
应用real-timePCR方法检测VDR及LL-37mRNA表达;应用westernblot方法检测VDR蛋白表达,应用ELISA方法检测培养液上清LL-37浓度;应用免疫荧光方法检测VDR及LL-37蛋白表达。
结果：
1、慢性肝病患者维生素D水平的研究:
维生素D缺乏或不足存在于98.3%的慢性肝病患者中。在全部肝硬化患者中,第三季度取材的患者血清25OHD水平高于第二及第四季度(P=0.019)。对第二季度119例慢性肝脏疾病患者的分析发现,慢性肝炎患者的血清25OHD水平显著高于肝硬化患者(P=0.001);随着肝硬化患者Child-Pugh分级的升高,血清25OHD水平逐渐下降(P=0.004)。相关分析发现,血清25OHD水平与反映肝脏合成及代谢功能的指标存在相关性(P＜0.05)。维生素D缺乏的危险因素包括:肝硬化(慢性肝炎/肝硬化)、及血清总胆红素(totalbilirubin,TBIL)水平高(P＜0.05)。
2、肝硬化并发自发性细菌性腹膜炎患者腹腔白细胞抗菌肽及其调控分子的表达:
肝硬化腹水患者也存在与肝脏疾病严重程度相关的维生素D水平低下状态,而且他们的腹水25OHD水平也普遍偏低,且与血清25OHD水平呈正相关(r=0.74,P＜0.001)。肝硬化并发SBP患者的腹腔白细胞VDRmRNA1及LL-37mRNA2的表达均高于单纯腹水患者(P1=0.005,P2=0.003);在并发SBP患者中,两者存在正相关(r=0.70,P=0.001)。
3、维生素D对肝硬化腹水患者腹腔巨噬细胞抗菌肽表达的干预研究:
维生素D单独孵育可显著上调腹腔巨噬细胞LL-37mRNA的表达,而且维生素D浓度越大,上调作用越显著(P=0.004);表达的高峰时间为孵育36小时(P＜0.001)。在维生素D缺乏的条件下,LPS可抑制腹腔巨噬细胞VDRmRNA1及LL-37mRNA2的表达(P1=0.007,P2＜0.001);而维生素D可逆转这种抑制作用,而且对LL-37表达水平的逆转随着维生素D浓度的升高而增强(P＜0.001);相比于LPS孵育,两者共同孵育可上调VDR1及LL-372的表达(P1＜0.001,P2=0.026)。
结论：
维生素D缺乏在慢性肝病患者,特别是肝硬化患者中非常普遍。
维生素D水平存在季节性差异且与慢性肝病严重程度相关。
维生素D-VDR系统及其下游免疫分子LL-37参与SBP的发病机制。
维生素D对于腹腔巨噬细胞对细菌产生有效的LL-37应答至关重要。
补充维生素D可以通过上调腹腔巨噬细胞的LL-37表达,从而增强肝硬化腹水患者抵御SBP形成的免疫防御功能。