论文部分内容阅读
[目的]成软骨分化（Chondrogenic differentiation）是指间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）凝集成软骨前体细胞并定向分化为软骨细胞（Chondrocytes）的一系列复杂过程。成软骨分化不仅对软骨生长发育至关重要,也是软骨创伤修复以及组织再生工程中最重要的环节之一,受到多种生长因子、转录因子及信号通路的时空调控,而其中复杂精细的调控机制目前仍不清楚。长链非编码RNA（Long noncoding RNAs,lncRNAs）是指一类转录本长度超过200nt的非编码调节性RNA。越来越多的证据表明,lncRNAs可以通过其特殊的结构与DNA、RNA、蛋白质发生靶向结合,从转录以及转录后水平调控生物发育、染色体失活、基因组印记以及表观遗传等多种生命活动。然而,关于lncRNA在软骨细胞分化中的调控作用尚不清楚。本课题以小鼠成软骨细胞系ATDC5为研究模型,拟通过基因芯片技术筛选出ATDC5细胞成软骨分化中差异表达的lncRNAs,应用生物信息学方法分析预测lncRNAs的生物学功能,筛选出目的lncRNA AK136902,并通过功能实验初步探索lncRNAAK136902在ATDC5细胞成软骨分化中的调控作用,为揭示软骨生长发育机制以及软骨疾病的治疗提供一定的实验依据。[方法]1.用1%的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠（insulin-transferrin-sodium selenite,ITS）诱导小鼠ATDC5细胞,建立ATDC5细胞成软骨分化的体外模型,应用阿新蓝染色、qRT-PCR、Western Blot检测诱导分化不同时间点（0d、ld、7d、14d、21d、28d）软骨分化标记分子Aggrecan、Co12a1、Sox9和肥大成熟标记分子Runx2、Col10a1的表达情况进行验证。2.应用阿新蓝染色、qRT-PCR、Western Blot、免疫组化检测诱导分化14d后,分化与未分化的ATDC5细胞中软骨细胞标记分子Aggrecan、Col2al、Sox9的表达情况。3.应用Arraystarmouse lncRNA+mRNAArray V3.0微阵列芯片筛选出分化（14d）与未分化（0d）ATDC5细胞中差异表达的lncRNAs并采用qRT-PCR技术对11个lncRNAs进行验证。4.运用基因本体论（Gene Ontology,GO）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析、CNC（coding and noncoding co-expression）以及ceRNA（Competing endogenous RNA）网络预测对差异表达的 lncRNAs 和 mRNAs进行功能分析及预测。5.qRT-PCR检测lncRNAAK136902、AK016344以及ENSMUST00000180767在ATDC5细胞成软骨分化不同时间点（0d、3d、7d、10d、14d）的表达情况,并明确其与软骨分化相关基因Aggrecan、Col2al以及Sox9之间的相关性。qRT-PCR检测lncRNA AK136902在1周龄和6周龄的C57BL/6小鼠的四种不同软骨组织（膝关节软骨、下颌髁突软骨、椎间盘软骨、耳廓软骨）中的表达情况。6.构建shRNA慢病毒稳定敲低lncRNAAK136902的ATDC5细胞系,应用SRB实验检测敲低lncRNAAK136902对ATDC5细胞增殖活性的影响。应用阿新蓝染色、qRT-PCR、Western Blot检测敲低lncRNA AK136902后,ATDC5细胞成软骨分化0d、7d、14d,软骨分化标记分子Aggrecan、Col2al以及Sox9的表达情况。在稳定敲低lncRNAAK136902的ATDC5细胞中过表达Sox9,应用qRT-PCR、Western Blot检测ATDC5细胞成软骨分化0d、14d软骨分化标记分子Aggrecan的表达情况。7.应用核质分离实验明确lncRNA AK136902的细胞亚定位。通过蛋白稳定性实验检测lncRNAAK136902对ATDC5细胞成软骨分化过程中Sox9蛋白稳定性的影响。[结果]1.1%ITS诱导后,阿新蓝染色在第7d开始显著增高。软骨分化标记分子Aggrecan、Col2al、Sox9的表达在诱导分化过程中逐渐升高,在14d达到峰值,之后逐渐下降,肥大成熟标记分子Runx2、Col10al的表达在诱导分化过程中逐渐升高,在28d左右达到峰值。2.与未分化（0d）的ATDC5细胞相比,分化（14d）的ATDC5细胞中软骨分化标记分子Aggrecan、Co12al、Sox9的mRNA及蛋白表达水平均显著升高。3.ATDC5细胞成软骨向分化中共有1099个lncRNAs和1206个mRNAs差异表达,对差异变化最大的11个lncRNAs的qRT-PCR验证结果与芯片结果一致;4.GO以及KEGG的结果显示,差异表达的mRNAs的功能主要与系统发育、细胞外基质相互作用、TGF-β以及PI3K-Akt信号通路有关。CNC基因共表达网络显示,lncRNAAK136902、AK016344、ENSMUST00000180767、ENSMUST00000181776、NR015466 以及 AK035926等lncRNAs与Col2al、Ibsp以及Ptgfr等软骨细胞分化相关基因的表达相关。ceRNA网络包含3个lncRNA、121个miRNAs以及241条作用关系,lncRNA AK136902、AK016344 以及 ENSMUST00000180767 等 3 个 lncRNAs 可能作为ceRNA参与调控成软骨分化。5.qRT-PCR的结果显示AK136902、AK016344以及ENSMUST000001807673等3个lncRNAs的表达在成软骨分化过程中逐渐升高,至14d左右达到峰值,且与与软骨分化标记分子Aggrecan与Sox9的表达正相关。lncRNAAK136902在1周龄和6周龄的C57BL/6雄性小鼠的膝关节软骨、下颌髁突软骨、椎间盘软骨以及耳廓软骨中均有表达。6.成功构建了稳定敲低lncRNA AK136902 的 ATDC5 细胞系。敲低 lncRNAAK136902 可以抑制 ATDC5细胞成软骨向分化过程中的细胞增殖活性。在ATDC5细胞成软骨向分化的0d、7d以及14d,敲低lncRNA AK136902可以从mRNA及蛋白水平显著抑制Aggrecan的表达。敲低lncRNAAK136902不影响Sox9的mRNA表达,但是却可以抑制Sox9蛋白的表达。敲低lncRNAAK136902可以抑制分化早期（7d）Co12al的mRNA以及蛋白的表达,但对分化后期（14d）Col2a1的表达无影响。在ATDC5细胞成软骨分化中,过表达Sox9可以回复敲低lncRNA AK136902所致的Aggrecan表达下调。7.定位于细胞浆的lncRNAAK136902可以通过提高Sox9蛋白的稳定性来调控ATDC5细胞的成软骨分化。[结论]1.应用1%lTS建立的ATDC5细胞成软骨分化体外模型能够很好地模拟软骨细胞的分化以及肥大成熟的过程。在诱导分化14d后,ATDC5细胞可分化为软骨细胞。2.高通量基因芯片与qRT-PCR技术相结合是研究lncRNAs的一个有效的方法。通过构建CNC以及ceRNA作用网络可以预测lncRNAs的生物学功能。3.lncRNAAK136902在ATDC5细胞成软骨分化中表达上调,且在C57BL/6小鼠的膝关节软骨、下颌髁突软骨以及椎间盘软骨中具有时空特异性表达模式,可以作为软骨细胞分化成熟的一个新的指标。4.lncRNAAK136902主要定位于细胞浆,其可以通过影响细胞增殖活性以及提高转录因子Sox9蛋白的稳定性来调控ATDC5细胞成软骨分化。