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[研究目的]越来越多的研究表明,肿瘤的发生、发展过程是与其周围的免疫细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等肿瘤微环境中各种成分动态相互影响的结果。而其内的各种促进肿瘤及抑制肿瘤发展的炎性反应共同影响着肿瘤的演进过程。最新的研究发现肿瘤微环境中Ⅰ型干扰素及其下游关键信号通路分子的缺失（STAT1、STAT2等）可间接促进免疫抑制状态的产生,最终导致肿瘤的增殖及转移;而更重要的是肿瘤细胞可减少其内源性Ⅰ型干扰素的释放,从而导致免疫逃逸。肿瘤微环境内如何实现促炎及免疫抑制的转换仍然是本学科一个未解决的问题。人成纤维细胞激动蛋白（fibroblast activation protein,FAP）是一种整合于细胞膜上的Ⅱ型丝氨酸蛋白酶,为肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts,CAFs）表面最重要的标记物之一。目前研究发现FAP主要表达于90%的上皮源性恶性肿瘤周围的活化成纤维细胞表面及一过性表达于骨髓间充质细胞、伤口周围组织及某些纤维化病灶中,而其在良性病变中基本不表达。FAP参与了肿瘤微环境中局部免疫反应的形成,阻断FAP的功能可抑制肿瘤的增殖。而同时给予Interferon-γ和TNF-α的中和性抗体又能促进肿瘤的增殖。这提示FAP可能调控局部干扰素和肿瘤坏死因子的表达。另外在CAFs相关的动物模型中研究发现FAP参与JAK-STAT信号通路的激活,这也是Ⅰ型干扰素的主要效应通路。本课题组在前期工作中成功构建了过表达FAP的小鼠成纤维细胞株（3T3）,且分离得到FAP阳性的CAFs。通过转录本测序及生物信息学方法,发现FAP可下调干扰素诱导基因（RIG-I、STAT2、IRF7等）。因此我们有理由相信CAFs表面表达的FAP可能通过下调ISGs的表达并诱导肿瘤微环境对Ⅰ型干扰素产生失能和效应抵抗。为了在人肺癌细胞及动物模型中验证这一科学假说,同时探讨肺腺癌患者中FAP的表达是否与患者预后相关。我们设计并完成了以下实验,实验方法及结果内容如下:[方法]一、组织芯片及TCGA数据分析FAP在肺腺癌人群中的表达和预后通过大样本的人肺腺癌组织芯片结果及对比TCGA数据,分析FAP在肺腺癌组织和癌旁组织内的表达情况及FAP与肺腺癌患者预后之间的关系。二、成纤维细胞激动蛋白促进肺腺癌增殖的机理研究细胞实验:将FAP过表达慢病毒（OE）和空载体对照病毒（NC）分别感染目的细胞株HFF、BJ及SPC-A-1,构建FAP过表达及阴性对照细胞模型。应用Cell counting kit-8（CCK8）检测过表达FAP后各细胞株的增殖能力,将Poly（I:C）通过转染试剂转染至FAP过表达及对照细胞株后,应用ELISA试剂盒检测内源性IFN-β释放的情况。并分别将待测细胞株FAP-3T3、NC-3T3、小鼠CAFs、FAP-HFF、NC-HFF、FAP-BJ及NC-BJ细胞株进行转录本测序并生物信息学分析,行qPCR及Western Blot实验验证下游分子机制。动物模型:给予裸鼠皮下注射FAP过表达及相应对照细胞株（FAP-HFF+SPC-A-1、NC-HFF+SPC-A-1及FAP-SPC-A-1、NC-SPC-A-1）,同时在瘤旁皮下注射Ⅰ型干扰素,观察并测量裸鼠体重、肿瘤体积和肿瘤重量。裸鼠移植瘤组织行HE染色及免疫组化检测干扰素诱导基因的表达情况。[结 果]一、临床样本及TCGA数据分析FAP在肺腺癌人群中的表达和预后选择94例临床可手术的肺腺癌患者作为研究对象,对其手术后肺腺癌病理标本进行针对FAP的免疫组化分析发现:FAP在癌胞浆中呈高表达为29例（31.52%）,低表达63例（68.48%）;而在癌旁胞浆中均为低表达。FAP在癌间质中呈高表达为49例（53.26%）,低表达43例（46.74%）;在癌旁间质中除2例高表达（2.38%）外,其余均为低表达。肺腺癌及癌旁组织内FAP的表达差异具有统计学意义（P<0.05）。肺腺癌患者术后10年随访的生存分析数据显示肺腺癌间质内FAP高表达的患者预后更差,结果具有统计学差异（P=0.019）。二、成纤维细胞激动蛋白促肺腺癌增殖的机理研究本研究体外实验证实:人成纤维细胞株FAP-HFF、FAP-BJ及肺腺癌细胞株FAP-SPC-A-1,小鼠成纤维细胞株FAP-3T3的增殖能力均高于对照组,同时给予外源性Ⅰ型干扰素刺激后,FAP过表达细胞株的增殖能力同样高于对照组（P<0.05）。将Poly（I:C）转染至FAP过表达及对照细胞株后,ELISA实验证实FAP可减少内源性IFN-β的释放（P>0.05）。同时进行转录本测序及生物信息学分析后提示FAP可能通过上调细胞增殖相关分子（细胞周期、细胞分裂等）及下调Ⅰ型干扰素相关信号分子从而促进肺腺癌细胞增殖,并通过qPCR及Western Blot验证相对于NC-HFF和NC-3T3,FAP-HFF及FAP-3T3细胞株中STAT2蛋白表达有下调。FAP-SPC-A-1细胞中细胞周期相关蛋白CCNB1的表达有上调,而FAP-HFF及NC-HFF细胞株中CCNB1的表达无明显差异。动物实验结果证实:于BALB/c裸鼠背部皮下分别接种FAP-SPC-A-1及对照细胞株,FAP-HFF和SPC-A-1混合细胞液及相应对照细胞株,同时分别于瘤旁注射人IFN-α2b 20000U/只/d,发现Ⅰ型干扰素可促进FAP过表达细胞株的体内成瘤（P<0.05）。裸鼠移植瘤免疫组化染色后显示:未给予外源性Ⅰ型干扰素刺激时,STAT1、STAT2、ISG15、IRF7在各实验组移植瘤中表达无差异,结果无统计学意义（P>0.05）。而给予外源性Ⅰ型干扰素刺激后,干扰素组（FAP-SPC-A-1和FAP-HFF+SPC-A-1）相对于观察组而言,STAT1、ISG15、IRF7表达上调,结果具有统计学意义（P<0.05）。并且在干扰素组中,FAP-SPC-A-1组及FAP-HFF+SPC-A-1 组相对于对照细胞组（NC-SPC-A-1 组及 NC-HFF、SPC-A-1）组而言,STAT2下调明显,结果具有统计学意义（P<0.05）。[结 论]一、FAP在人肺腺癌组织内相比癌旁为高表达,且肿瘤间质内FAP高表达的患者预后更差,结果具有统计学差异（P=0.019）;二、FAP可在体外促进人成纤维细胞株HFF、BJ,人肺腺癌细胞株SPC-A-1及小鼠成纤维细胞株3T3的增殖,机制可能为上调细胞周期蛋白CCNB1的表达;三、FAP可在体内外Ⅰ型干扰素的刺激下促进细胞株（HFF、SPC-A-1）的增殖,机制可能为下调STAT2的表达;四、FAP可减少体外小鼠成纤维细胞株3T3及人成纤维细胞株HFF中内源性Ⅰ型干扰素IFN-β的释放。