【摘 要】
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纳豆激酶是纳豆芽孢杆菌产生的高效和安全的溶栓酶。本研究从纳豆芽孢杆菌中提取DNA，克隆出纳豆激酶的全长基因pre-pro-NK和成熟肽基因NK，研究其在原核生物中的表达，及表达的包
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纳豆激酶是纳豆芽孢杆菌产生的高效和安全的溶栓酶。本研究从纳豆芽孢杆菌中提取DNA，克隆出纳豆激酶的全长基因pre-pro-NK和成熟肽基因NK，研究其在原核生物中的表达，及表达的包涵体蛋白的复性等，为基因工程生产高活力的纳豆激酶奠定基础。主要研究结果如下： (1)重组菌的构建。提取纳豆芽孢杆菌的基因组DNA，PCR扩增编码纳豆激酶的全长基因pre-pro-NK和成熟肽基因NK，将其克隆到载体pMD-19T中。测序表明，纳豆激酶全长基因为1143bp，成熟肽基因为825bp，与GenBank中报道的序列(AF368283)同源性均达到100％。成功构建表达载体pET32a-pre-pro-NK、pET32a-NK和pQE30-pre-pro-NK、pQE30-NK，将其转化入大肠杆菌中得到重组菌。 (2)纳豆激酶的表达及活性测定。在重组菌培养液中加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG，于37℃下诱导6小时，pET32a重组菌和pQE30重组菌均能表达重组蛋白。可溶性分析表明，含pQE30-pre-pro-NK的重组菌表达的蛋白分泌到胞外，其他重组菌表达的蛋白都以不可溶的包涵体形式存在.采用改进后的纤维蛋白平板法对表达的蛋白进行酶活测定，结果显示含pET32a载体的重组菌所表达的蛋白均没有活性，含pQE30-pre-pro-NK的重组菌表达的胞内和胞外蛋白都有少量的活性，含pQE30-NK的重组菌在胞内可溶性的蛋白有少量活性，且pQE30载体自身所带冗余序列少，选择pQE30-NK重组菌作为包涵体复性研究对象。 (3)包涵体的传统复性。比较3种不同传统复性方法，用1％TritonX-100和20mMpH为8.0的Tris-HCl将包涵体洗两次后，再用尿素进行复性，得到的NK活性为30.95IU/mg。 (4)影响包涵体复性因素的筛选.采用96孔板筛选法系统地对包涵体的溶解效果进行研究，选择pH12的水作为溶解试剂。对复性液的成分组合、浓度、pH值均进行系统的探索，并测试了不同溶解和复性时间对复性结果的影响。筛选出最优的复性液为：50mMTris-HCl，10mMNaCl，10mMMgCl2，10mMEDTA，0.4ML-精氨酸，0.05M蔗糖，pH为9.0，溶解最佳时间为6小时，复性最佳时间为1分钟。 (5)新型复性方法的探索。研究了植物种子发芽后芽尖提取物、生物提取物(酵母提取物，大肠杆菌提取物)、极性与非极性溶剂混合环境以及高pH滴定法对包涵体复性效果的影响，其中只有生物提取物能促进包涵体的复性。加入生物提取物提取物后，包涵体由无活性的形式变为有活性，所测酶活分别为32.84IU/mg和22.4IU/mg，相当于传统复性方法复性后的1.06倍和0.72倍。在试验的基础上提出了一种新型的快速复性法，通过此方法复性后的包涵体所测酶活为79.35IU/mg，是传统复性方法复性后所测酶活的2.56倍。 本研究构建了纳豆激酶的原核表达系统，重组菌体诱导后获得大量的包涵体，通过系统地摸索包涵体蛋白复性的各种影响因素，得出纳豆激酶包涵体复性的最佳条件，提出了一种新型快速经济环保的复性方法，对包涵体复性的更深入研究提供了有力的依据。
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