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本论文设计、合成了系列新型的水溶性共轭聚合物,利用这些新型荧光探针在蛋白质的分析及检测领域开展了以下几方面的工作:
1.设计,合成了阳离子聚芴衍生物并构建了基于荧光共振能量转移(FRET)机理的亲和素蛋白(streptavidin)检测体系。阳离子聚芴与带负电荷的荧光素标记的生物素(Biotin)通过静电相互作用形成复合物,当检测体系中没有目标蛋白质时,发生聚合物到荧光素的能量转移;加入目标蛋白质后,蛋白质与生物素的特异性结合作用促使荧光素包埋在蛋白质的空腔中,阻断能量转移的发生。根据上述两种情况下荧光素和聚合物发射荧光强度比率的不同可以实现对亲和素蛋白的检测,此方法的优势在于较大程度地提高了检测灵敏度同时降低了外界因素的干扰。
2.肽链(Rev)和RNA(RRE)之间的特异性相互作用在HIV疾病发展过程中起到重要作用,阻断Rev-RRE相互作用的化学小分子有望用于治疗HIV。作者以阳离子水溶性共轭聚合物为探针发展了一种新型的检测体系用来筛选潜在的HIV药物。其作用机理如下:荧光素标记的肽链Rev由于静电斥力作用不能与正电荷聚合物发生能量转移,加入RNA RRE后可形成聚合物/RRE/Rev三元体系,拉近了肽链Rev与聚合物之间的距离从而发生从聚合物到荧光素的能量转移;加入阻断Rev-RRE特异性相互作用的化学小分子后,Rev被顶替释放从而远离聚合物/RRE体系,阻断能量转移的发生,通过检测能量转移信号的变化可以实现对药物小分子的筛选。
3.发展了新型无标记、高灵敏度的蛋白酶活性和抑制剂筛选新检测体系。以主链含有苯并噻唑聚芴衍生物为荧光探针,实现了对胰蛋白酶以及碱式磷酸酶活性的实时检测。这种传感器的作用机制是:多电荷底物(肽链或ATP)可以诱导带相反电荷的苯并噻唑聚芴聚集并发生从芴单元到苯并噻唑单元的能量转移,检测溶液呈现出噻唑的绿色荧光;加入胰蛋白酶或磷酸酶后,多电荷底物被裂解成小的碎片,低电荷密度的碎片不能使聚合物聚集,不能发生从芴单元到苯并噻唑单元的能量转移,检测溶液呈现聚芴的蓝色荧光,通过酶分子作用前后聚合物聚集态变化而导致的荧光信号改变可实现对酶活性的检测,该体系还可用于酶抑制剂筛选。
4.不同等电点的蛋白质在缓冲溶液(pH=7)中呈现不同的电荷状态(正,负或中性),它们可以不同程度的诱导含有苯并噻唑的聚芴衍生物发生聚集,以聚合物的荧光发射光颜色作为输出信号即可以实现对蛋白质的定性分析。此外,负离子聚合物可以调节胰蛋白酶表面的电荷性质与密度,以此改变酶与不同底物的相互作用从而起到对酶活性进行调节的目的。
5.设计合成了两种新型的含苯并噻唑的阳离子水溶性聚芴衍生物,并研究了缓冲溶液离子强度的变化对其聚集态的影响。选择具有较好性能的聚合物作为探针实现了对透明质酸酶的灵敏检测。其作用机制为:负电荷的底物透明质酸可以与阳离子聚合物形成静电复合物,诱导其聚集并发生从芴单元到苯并噻唑单元的能量转移;加入透明质酸酶后,底物透明质酸被水解为短的片段,阻断能量转移过程的发生。通过酶分子作用前后聚合物荧光信号改变可实现对透明质酸酶的检测。
6.以侧链含有丝氨酸基团的聚噻吩为探针,设计了基于竞争性螫合机理的胰蛋白酶活性检测体系。铜离子被聚合物中的丝氨酸络合后可以淬灭其荧光,但当蛋白质(BSA)被胰蛋白酶(trypsin)水解释放出络合能力更强的短肽片断后,铜离子远离聚合物,从而聚合物的荧光恢复,通过酶分子作用前后聚合物荧光信号改变可实现对胰蛋白酶的灵敏检测。
7.设计合成了含有羟基的新型水溶性聚苯衍生物,以此为检测平台构建了ChT酶的活性分析体系。硝基苯化合物在不同pH值溶液中呈现不同的电离状态并且其吸收光谱也会随之而改变,离子态的硝基苯吸收光谱与聚苯化合物的发射光谱有部分重叠,聚苯的荧光发生淬灭并且最大发射峰发生红移。以硝基苯衍生物为酶底物,通过检测聚苯的荧光信号变化可以实现对ChT胰蛋白酶的检测。