猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要病原,也被证明与猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍等多种猪圆环病毒病相关。PCV2的ORF2基因编码的Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白,具有良好的免疫原性,是机体抵抗PCV2感染的主要免疫原。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了两株能表达PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒。首先克隆了ORF2△41基因,即缺失ORF2编码蛋白前41个氨基酸的核定位序列的ORF2基因、蜂毒肽基因(MEL基因)以及六聚组氨酸标签基因(6H基因),并引入合适的酶切位点,将其插入FastBacTM1转移载体,获得了两个重组载体质粒,一个为插入了两个串联的ORF2基因载体质粒,命名为FBDORF2。另一个为插入了单独的ORF2基因的载体质粒,命名为FBSORF2。然后将两个重组质粒分别转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,同源重组后使目的片段转移到重组杆粒DNA(Bacmid DNA)上。再分别以脂质体转染法将重组杆粒DNA转染到sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,分别命名为DORF2和SORF2。经PCR和测序鉴定,成功获得了两株重组杆状病毒。病毒滴度测得DORF2毒的TCID50为10-6.33/mL;SORF2毒的TCID50为10-6/mL。将两株重组杆状病毒接种sf9细胞,72小时后进行PCV2和六聚组氨酸标签的荧光抗体染色,结果显示,两株重组杆状病毒的均能见明显的阳性细胞,说明所构建的杆状病毒在昆虫细胞中成功表达。以两株重组杆状病毒分别感染悬浮培养的TriEx sf9细胞,培养72小时后收集细胞上清液,上清液经过滤后使用镍柱进行亲和层析纯化Cap蛋白。经SDS-PAGE鉴定,两株病毒的表达产物分别在约51KDa处和28KDa处有较单一且明显的条带,与预期大小基本一致,且DORF2毒株的表达量高于SORF2;Western-blot印迹表明,两个病毒表达的Cap蛋白均能与PCV2阳性血清发生特异反应。以纯化的Cap蛋白为基础,初步建立了检测PCV2抗体的间接ELISA检测方法。确定了ELISA反应的几个最佳反应条件:Cap蛋白的最佳包被浓度为0.31μg/mL;待检血清最佳稀释度为100倍稀释;最适酶标二抗的工作浓度为20000倍稀释;最适包被条件为4℃16小时;最佳封闭液为10%脱脂奶粉的PBS溶液;特异性试验证明,该方法与PRV、PPV、CSFV、PRRSV、猪丹毒、仔猪副伤寒、副猪嗜血杆菌等猪常见疾病的抗体均无交叉反应;以初步建立的ELISA方法检测采自河北保定农村散养猪的血清样本,其结果显示,田间样本的PCV2抗体阳性率为61.5%,与INGEZIM公司PCV2抗体检测试剂盒的检测结果符合率为94.8%。