一、研究背景: 生殖器疱疹(Genital Herpes，GH)是由单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)感染生殖器和肛门部位皮肤、粘膜而引起的一种慢性、易复发、难治愈的性传播疾病。对于这种在人群广泛流行、有潜在严重危害的病毒感染，目前却没有特效药物治疗。生殖器疱疹的病原体90％为HSV—2，10％为HSV-1。HSV基因组为一线性双链DNA分子，转录产物的形成可有时序上的先后，美国学者Roizman根据基因表达时序的不同，将HSV的基因分为立即早期、早期、晚期基因，分别称为α、β、γ基因，分别编码立即早期蛋白、早期蛋白及晚期蛋白。立即早期基因的转录出现在病毒DNA复制之前，调节着β、γ基因的表达。迄今为止，人们已知的HSV编码的立即早期蛋白有五个，它们被称为感染细胞多肽分子(infected cell polypeptides，ICPS)。包括ICPO，ICP4，ICP22，ICP27和ICP47。从位置上看，α27基因又称为UL54，它编码的ICP27具有复杂的调节作用，是唯一能在疱疹病毒的每个亚科找到其同源蛋白的α蛋白。 RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是近年来一种发展快并有应用前景的基因控制技术。双链RNA能够被一种称为Dicer的RNA酶加工成小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)，随后这些小干扰RNA与蛋白因子形成RNA诱导的沉默复合物(RNA—induced silencing complex，RISC)，该复合物可以识别并降解与siRNA具有同源序列的mRNA。RNAi作用具有高度的序列特异性，这种特异性抑制基因表达并使表现型丧失的方法类似于基因敲除的效果，故RNAi已成为研究基因功能的重要工具。自从2002年第一次报道RNAi在哺乳动物细胞中能抑制病毒复制以来，RNAi已经广泛用于各种抗病毒研究，并取得大量令人振奋的结论。在国际上，针对HSV的RNA干扰治疗研究起步相对较晚。到目前为止，可查阅的国内外使用RNAi技术治疗HSV—2感染文献不超过10篇，且绝大部分来自欧美国家。2006年，Palliser等发现，小鼠阴道宫颈粘膜上皮能摄取脂质体包裹的siRNA，被摄取的siRNA在局部能产生效果。体外实验中，针对某些靶基因筛选出有效抑制HSV—2的siRNA；转到体内实验，在阴道粘膜使用含siRNA的制剂，保护了受致死剂量HSV—2攻击的小鼠。这些结果显示了使用RNA干扰技术治疗HSV感染的可能性、有效性以及瞩目的前景。 HSV—2病毒感染的周期以及其中有关的重要基因的表达特性是学者们选择siRNA抗病毒靶点的重要依据。最近研究发现ICP27为病毒复制所必需，一旦发生突变则可能影响晚期基因的表达和DNA的合成。HSV—2具有相对独立的自身复制酶系统，包括UL30、UL29、UL9、UL42编码的复制相关酶，这些酶直接参与病毒DNA的复制，而ICP27的缺失可导致这些复制相关酶合成减少，影响病毒的复制；另一方面，在病毒与宿主细胞相互作用的过程中，ICP27通过抑制宿主细胞原始RNA的剪接和加尾等成熟过程，与UL41基因编码的病毒宿主关闭蛋白(Virion host shutoff protein，VHS蛋白)共同调节宿主mRNA的代谢过程，抑制宿主细胞蛋白的合成。可见，ICP27对于HSV—2来说是个关键的上游蛋白，且对宿主细胞代谢有重要影响，如能够特异性地干扰ICP27的表达过程，则可能起到抗病毒和保护宿主细胞的作用。因此，本实验利用RNA干扰技术，研究特异性siRNA对HSV—2复制的影响，评价UL54基因在病毒复制中的作用，为确立其作为抗HSV—2的药物靶标奠定基础，为抗病毒治疗提供新方法新思路。 二、研究目的: (1)根据siRNA设计原则，筛选UL54基因可能的靶位，合成实验组siRNA。 (2)探讨在RNAi技术条件下，干扰ICP27合成对HSV—2复制的影响及对宿主细胞的保护作用，为有效抗病毒治疗提供依据。 (3)筛选有效和特异性抑制UL54表达的siRNA分子。 (4)评价UL54基因在HSV—2复制中的作用，为确立UL54基因作为抗HSV—2的药物新靶标奠定基础。 三、材料与方法: 1.实验材料：HSV—2病毒悬液；vero细胞株；六对siRNA(四对针对UL54基因的实验组siRNA： R1、R2、R3、R4；阳性组siRNA；阴性组siRNA)、带有FAM标记荧光的siRNA(FAM—siRNA)。 2.细胞培养和传代：传代细胞株vero细胞用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基进行培养，待细胞长到致密单层时，进行消化传代。 3.病毒增殖：vero细胞长成单层后，接种病毒，加入病毒维持液，每天观察，80％细胞出现病变后，反复冻融三次，收获病毒。 4.siRNA的设计和合成：检索Genebank查找UL54的基因，分析其保守序列，筛选出靶序列，化学合成法合成四对实验组siRNA和阳性、阴性对照siRNA。 5.siRNA转染：用FAM—siRNA进行优化转染条件；以获得较高转染率的转染条件进行实验组的siRNA转染。 6.病毒的感染：转染了siRNA的六组细胞和未进行转染的空白组细胞分别接种每孔100TCID50/100μl的HSV—2，分别于接种后12h、24h、36h、48h、60h、72h观察纪录细胞病变情况，并收集上清液进行病毒滴度测定。 7.病毒滴度测定：在96孔板中进行病毒液的系列倍比稀释，按Reed—Mrench法计算，能引起50％培养细胞发生病变(++)的病毒最高稀释度(TCID50)即病毒滴度。 8.MTT比色法测细胞活力：细胞传代接种至96孔培养板，转染了siRNA和未转染的空白组，于病毒感染后12h、24h、36h、48h、60h、72h进行MTT比色法测定各组细胞的存活情况。 9.统计学处理：采用两独立样本t检验、随机区组方差分析，在SAS8.0系统完成。P<0.05有统计学意义。 四、结果: 1.合成了实验用的六对双链siRNA。24孔培养扳中，按1μ/孔Lipofectamine2000，2μ/孔(40nM)的FAM—siRNA转染的细胞孔，荧光效果最好，流式细胞学检测转染效率达到70-90％，转染效果好。 2.针对UL54基因的siRNA转染组在病毒复制早期(12-24小时)即已经出现明显的病毒滴度较空白组降低；病毒复制晚期，各组病毒滴度仅稍微降低。 3.各转染了特异性siRNA的细胞较空白组细胞病变出现迟，MTT比色法测得OD值较空白组高，细胞存活情况较好。 4.其中，R2和R4组在病毒复制早期到晚期病毒滴度均较其它组低，细胞病变出现也较迟。 五、结论: 1.根据siRNA设计原则设计合成的实验组siRNA，在合适的转染条件下，能够得到较好的转染率。 2.UL54基因特异性siRNA干扰ICP27的合成，能够抑制病毒的复制，降低子代病毒滴度，同时对宿主细胞具有保护作用，细胞病变和坏死少。这为siRNA治疗HSV—2感染提供初步理论依据。 3.按照同样的设计原则合成siRNA，作用效果存在明显差异。进一步研究高效和无效siRNA的共性，将为基因结构功能的研究提供依据，也为设计原则提供补充。 4.本实验再次验证UL54基因在病毒复制中的重要作用，为确立UL54基因作为抗HSV—2药物新靶标奠定基础。