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目的牙菌斑是龋病的始动因子,变形链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)是牙菌斑中的主要致龋菌。S.mutans粘附在牙齿表面形成牙菌斑,是龋病形成的重要环节。Sortase A酶(编码基因Srt A)介导S.mutans表面蛋白(如表面蛋白Spa P)与细菌细胞壁共价结合的蛋白酶,在S.mutans对牙面的粘附中起着重要作用。本研究在前期工作的基础上进一步分析柠檬精油(lemon essential oil,LEO)对S.mutans疏水性、粘附性、基因srtA的影响,并与LEO的主要成分柠檬烯(limonene,LIM)以及防龋植物产物茶多酚(tea polyphenol,TP)作对比,为天然口腔防龋材料的研发提供实验依据。内容通过体外实验研究经LEO、LIM、TP处理后,S.mutans的表面疏水性、粘附性和srtA、spa P基因表达水平的变化,探讨LEO等减低S.mutans毒性作用从而抑制牙菌斑形成的可能机制。方法1.LEO的提取、抑菌及细胞增殖实验采用水蒸气蒸馏法提取挥发油,测定LEO、LIM、TP对S.mutans的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC),MTT法测定LEO对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。2.测定LEO、LIM及TP对S.mutans疏水性、粘附的影响选用微生物黏着碳氢化合物法测定低于MIC五个浓度的LEO、LIM及TP对S.mutans表面疏水性的影响。通过96孔微孔板结晶紫染色法,测定不同浓度植物产物对S.mutans在蛋白包被聚苯乙烯表面粘附的影响,并将结果进行比对。3.测定LEO、LIM及TP对S.mutans的srtA、spa P基因转录水平表达的影响采用实时荧光定量PCR方法,测定不同浓度植物产物处理后S.mutans的srtA、spa P基因的表达水平。4.采用SPSS19.0软件进行数据分析,采用单因素方差分析(ANOVA)进行各实验和对照组总体均数的比较,并计算F值;在F值有意义的前提下,再进行多个实验样本均数之间的两两比较。结果1.LEO、LIM、TP对S.mutans的MIC分别为4.5mg/ml、21mg/ml、4mg/ml。1/20MIC浓度的LEO作用于人脐静脉内皮细胞后,细胞增殖率为92.9%;与空白组相比,1/200MIC浓度的LEO对人脐静脉内皮细胞增殖的影响,差异不具有统计学意义。2.未经药物处理的S.mutans的表面疏水性为76.725%。低于MIC的LEO(1/2MIC~1/20000MIC)、LIM(1/2MIC~1/2000MIC)、TP(1/2MIC~1/20000MIC),对S.mutans表面疏水性具有抑制作用,抑制作用随药物浓度的升高而逐渐增高(FLEO=1013.944,FLIM=482.48,FTP=618.109,P<0.05)。比较1/2MIC浓度下三种天然植物成分对S.mutans表面疏水性的抑制作用,LEO>LIM>TP,差异有统计学意义(F=91.041,P<0.05)。相同浓度下,LEO对S.mutans表面疏水性的抑制作用始终高于LIM。1/2MIC、1/20MIC浓度下,LEO对S.mutans表面疏水性的抑制作用高于TP。3.低于MIC的LEO(1/2MIC~1/200MIC)、LIM(1/2MIC~1/20MIC)、TP(1/2MIC~1/200MIC),对S.mutans蛋白包被的聚乙烯表面粘附具抑制作用(FLEO=73.939,FLIM=57.264,FTP=73.410,P<0.05)。比较1/2MIC下三种天然植物成分对S.mutans粘附的抑制作用,差异无统计学意义(F=1.43,P>0.05)。4.低于MIC的LEO、LIM、TP,对S.mutans的srtA基因表达具有抑制作用;从1/200MIC到1/2MIC的浓度范围内,随着LEO、LIM、TP浓度的逐渐升高,srtA基因的m RNA表达水平呈下降趋势。5.相同浓度下LEO对S.mutans的srtA基因表达的抑制作用始终高于LIM;比较LEO和TP对S.mutans的srtA基因表达影响,1/2MIC和1/20MIC浓度下LEO的抑制作用强于TP。6.低于MIC的LEO、LIM、TP,对S.mutans的spa P基因表达均无抑制作用。结论LEO、LIM、TP在亚抑菌浓度下,可以抑制S.mutans的srtA基因表达,降低S.mutans的表面疏水性,进而影响S.mutans的粘附性,其抑制作用具有浓度依赖性,随药物浓度的升高,抑制作用增强。LEO的抑制作用高于LIM、TP。LEO作为一种天然植物产物,具有较强的防龋应用前景,有望进一步研发安全具有防龋作用的新型植物药物。