研究背景原发性肝癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率占中国恶性肿瘤死亡率的第二位,为全球恶性肿瘤死亡率的第三位。随着肝癌“早期诊断,早期治疗”概念的提出,肝癌病人的5年生存率较以往有了较大的提高。目前,手术切除仍是肝癌病人获得长期生存的首选治疗方法,但是由于肝癌患者往往伴有肝硬化及肝功能减退,待到明确诊断时往往仅有20%的患者符合肝切除手术指征因此,在此情况下,肝癌肝移植作为既能同时切除肝癌及硬化肝脏,又能改善终末期肝病的一种治疗手段,开始被逐步接受。但是,移植后仍然无法避免肝肿瘤的复发转移,免疫抑制剂的应用是其主要危险因素之一。目前广泛认可的肝移植术后常规免疫抑制剂治疗方案为FK506/CsA加用骁悉及激素的三联用药,亦有部分移植中心尝试用雷帕霉素替代FK506或CsA。FK506与CsA均为钙调磷酸酶抑制剂,通过抑制神经钙调素磷酸酶的活性,进一步抑制IL-2的合成释放,抑制T、B细胞的增殖活化,达到临床的免疫抑制作用。部分细胞实验的结果显示CsA与FK506对肝癌细胞的生长无明显影响,但是更多的动物实验报道及临床回顾性调查研究提示,钙调磷酸酶抑制剂确实是导致肝癌肝移植术后肿瘤复发转移率增高的危险因素。因此,钙调磷酸酶类免疫抑制剂是否确实促进了术后肿瘤的复发及转移,仍然存有争议。趋化因子是一类小分子分泌性蛋白,通过趋化因子受体参与机体病理生理的调控。最初人们认为趋化因子因趋化并激活部分炎性细胞而主要参与一些免疫炎性反应。但是,近年来报道趋化因子参与肿瘤生长及转移的研究越来越多。其中最受瞩目的便是CXCR4/SDF-1α生物学轴。该生物学轴被认为广泛参与了肿瘤细胞的定向趋化及转移的过程。CXCR4是多种肿瘤细胞表达的趋化因子受体。SDF-1α由基质细胞分泌,在骨髓、淋巴结、肺脏和肝脏中持续性高表达,这些脏器往往是肿瘤转移的靶器官。这就提示了CXCR4/SDF-1α可能是在多种肿瘤的靶器官定向转移中起到了重要作用。多项实验研究表明,CXCR4/SDF-1α生物学轴的平衡改变可能导致肿瘤侵袭及转移能力的改变,假若FK506能促进肝癌肝移植术后肿瘤复发及转移,是否是因为调节了肝肿瘤细胞及周围基质细胞的CXCR4/SDF-1α生物学轴平衡?相应的,通过CXCR4拮抗剂AMD3100阻断CXCR4/SDF-1α之间的趋化作用,可否减弱FK506的促肿瘤生长及转移的作用?这就是本研究的意义所在。研究目的通过体外实验和大鼠动物实验研究免疫抑制剂FK506能否明确促进大鼠肝癌的生长及转移,以及CXCR4/SDF-1α在该过程中表达的改变及其临床意义。研究方法1.体外实验:1.1肿瘤细胞增殖实验——噻唑蓝比色法(MTT)大鼠肝癌MH3924a细胞分组培养,单独或联用不同浓度的FK506及CXCR4拮抗剂AMD3100,应用MTT法测定细胞的增殖情况。1.2扫描电镜观察将MH3924a 5×10~3铺于盖玻片(8×8mm~2)上,孵育1d后更换为含不同免疫抑制剂浓度的完全培养基继续培养,按扫描电镜标本制作规程处理后观察。1.3细胞免疫组化染色将MH3924a8×10~3传代于盖玻片(8×8mm~2)上,孵育1d后更换为含不同免疫抑制剂浓度的完全培养基继续培养。按细胞免疫组化操作流程处理,行CXCR4抗体染色,IPP软件分析蛋白表达。1.4细胞侵袭实验将MH3924a细胞分组,上室加用阴性对照、FK506干预、AMD3100干预,下室加用不同浓度的SDF-1α,按照细胞迁移实验及侵袭实验标准流程操作,分析细胞侵袭力的改变。2.体内实验2.1 2mm~3MH3924a肝癌瘤块手术植入ACI大鼠左肝,建立大鼠肝癌模型。2.2术后第5天的ACI荷瘤大鼠随机分为2组,一组给予生理盐水皮下注射,3mg/kg/d~*14d;一组给予FK506皮下注射,0.3mg/kg/d~*14d。2.3观察40天后处死,记录实验动物肿瘤生长、肺转移结节数及或其它脏器转移情况。2.4收集大鼠肝肿瘤标本,癌旁组织及肝正常组织标本,免疫组化检测肿瘤CXCR4及癌旁SDF-1α的表达。肺脏以15%印度墨汁灌染,冲洗并计数转移结节数量。Mann-Whitney秩和检验比较组间差异。研究结果1.体外实验中,FK506在低浓度(10ug/L)时,对MH3924a肝癌细胞的增殖无影响(P=0.135);在中、高浓度(100μg/L-1000μg/L)时,对MH3924a肝癌细胞的体外增殖有显著促进作用(P＜0.01);在FK506浓度恒定(100μg/L)时,分组应用不同浓度的AMD3100(10ng/ml、50ng/ml,100ng/ml)均无法改变FK506对MH3924a肝癌细胞体外增殖的促进作用(P＜0.01)。2.体外实验中,经FK506(100μg/L)干预培养后,CXCR4在MH3924a肝癌细胞中表达较阴性对照组有所增强,但无统计学差异(P＞0.05);经AMD3100(50ng/ml)干预培养后,CXCR4在MH3924a肝癌细胞中表达减弱(P＜0.05)。3.电镜实验:MH3924a细胞经FK506(100ug/L)处理后,表面有更丰富的微绒毛突起,组织形态更加富有侵袭性。经FK506和AMD3100联合处理后,微绒毛未明显减少,仍呈高侵袭表型的表现。4.肿瘤细胞侵袭实验中,FK506(100ug/L)干预后的MH3924a肝癌细胞穿胶的数量较阴性对照组明显增多,差异有统计学意义(P＜0.01);经SDF-1α(10ng/ml)诱导后的MH3924a肝癌细胞穿胶数量较阴性对照组明显增多,差异有统计学意义(P＜0.01);经FK506+AMD3100联合培养的MH3924a肝癌细胞穿胶能力较阴性对照组明显提高(P＜0.01),与FK506干预组相比呈减弱趋势,但差异无统计学意义(P=0.607),与SDF-1α诱导组相比明显减少(P=0.507)。5.体内动物实验结果表明:生理盐水组大鼠肺转移结节数为1.39±1.25个,FK506组肺转移结节数为6.50±4.63(P＜0.05)。100%的FK506组的大鼠发生了除肺转移及肝播散外的多脏器转移,包括腹壁肌肉、淋巴结等;仅20%的生理盐水组大鼠有此情况。6.体内动物实验组织免疫组化结果表明:相比阴性对照组,FK506干预组大鼠肝肿瘤CXCR4表达上调,差异有统计学意义(P=0.048);癌旁组织及正常肝组织SDF-1α均有明显提高,差异有统计学意义(P=0.026)。结论1.体外实验中,FK506可显著促进肝癌细胞侵袭力(10 ug/L-1000 ug/L)及增殖能力(100 ug/L-1000 ug/L);体内实验中,FK506明显促进了大鼠肝癌的生长及转移。2.FK506促进了大鼠体内肝肿瘤CXCR4及癌旁组织SDF-1α的表达上升。3.阻断肿瘤相关CXCR4/SDF-1α生物学轴可以部分减弱FK506导致的肿瘤侵袭力增强。