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本研究应用RACE方法成功的从盐生植物-猪毛菜(Salsola soda)中克隆了液泡膜型Na+／H+逆向转运蛋白全基因序列,构建了该基因的植物表达载体并转化紫花苜蓿,并对获得大量转基因苜蓿材料进行了耐盐性研究。
猪毛菜液泡膜型Na+／H+逆向转运蛋白全基因(SsNHX1)序列全长为1934 bp,包含一个长度为1680 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码559 aa个氨基酸残基。液泡膜型Na+／H+逆向转运蛋白的高度保守区-抑制剂氨氯吡嗪脒结合位点,Na+／H+交换泵(Na+／H+exchanger；NHE)和液泡膜型Na+／H+逆向转运蛋白特有的12段跨膜疏水结构域在蛋白序列中被发现。氨基酸序列多重比对分析表明,该蛋白与来自盐爪爪(Kalidium foliatum)、北滨藜(Atriplex gmelini)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、棉花(Gossypium hirsutum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)和玉米(Zea mays)的液泡膜型Na+／H+逆向转运蛋白相比,相似性分别达到了90％,87％,77％,76％,75％,74％,73％和72％。进化树分析表明,该蛋白与其他液泡膜型Na+／H+逆向转运蛋白亲缘关系较近,而与质膜型Na+／H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。在液泡膜型Na+／H+逆向转运蛋白中,与盐生植物-盐爪爪、北滨藜亲缘关系较近,而与甜土植物亲缘关系较远。该基因在酵母中表达能够提高酵母的生长速率,在烟草中表达能够有效的提高T1代转基因种子在含盐培养基中的发芽率,并且生物量和株高都比对照有明显的提高,充分验证了该基因抗盐功能。总之,SsNHX1基因是液泡膜型Na+／H+逆向转运蛋白基因家族的一个全新成员,同时,在植物中过表达此基因能够明显的提高转基因植株的耐盐碱能力。
苜蓿的基因型是影响苜蓿遗传转化的关键因素,只有很少的栽培品种适合建立高效的再生体系。本研究以14份国内外主栽品种作为供试品种,通过比较品种间的诱导能力,筛选到公农1号为最佳的基因型。在此基础上,以公农1号的嫩叶为外植体,建立了一套高效的农杆菌介导苜蓿遗传转化体系,成功将猪毛菜液泡膜型Na+／H+逆向转运蛋白基因导入苜蓿基因组中。Southern杂交证实有6个独立转化系为转基因阳性株系,最终获得了203株阳性植株。
本研究以来自6个独立转化系的苜蓿植株作为耐盐试验材料,进行盐胁迫试验。Northern杂交证实外源基因-猪毛菜液泡膜型Na+／H+逆向转运蛋白基因,在逆境胁迫启动子调控下,随着盐处理浓度的增高而表达量也逐渐增高。耐盐试验表明,与对照相比转基因植株具有明显耐盐能力,最高耐盐能力达到400 mM,而对照在200 mM的条件下逐渐死亡。并且转基因耐盐植株中具有更高Na+,K+的含量。生理分析表明,在盐胁迫条件下,转基因耐盐植株受到的伤害要比对照植株轻的多。转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)活性变化趋势小和脯氨酸含量增长幅度小,另外,转基因植株的相对电导率(REL)变化也较小,这些生理数据表明,猪毛菜液泡膜型Na+／H+逆向转运蛋白基因的表达能帮助转基因植物抵抗盐胁迫,有效的提高了转基因植株的耐盐能力。