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β-防御素属于抗菌肽，具有广谱抗微生物和免疫增强作用以及对病原微生物不易产生抗药性等优点而成为当前生物学的研究热点之一。它可以抵御细菌、真菌、被膜病毒外，还对支原体、衣原体、螺旋体以及一些恶性细胞杀伤作用，因此有望成为具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。猪β防御素-1(Porcineβ-defensin-1，PBD-1)是广泛分布于猪消化道、呼吸道、肝、肾等多种组织细胞内一类活性多肽，在猪防御系统中起重要作用，大量研究结果表明PBD-1抗菌肽具有独特的作用机制，病原菌不易对其产生耐药性。它可被用作食品保鲜剂和饲料添加剂，随着对其研究的深入，可以相信猪防御素在动物养殖，疾病防御和提高畜产品品质等方面发挥更大作用。 本研究的目的是在克隆猪骨髓防御素的基础上，根据毕赤酵母密码子偏好性设计并人工合成防御素成熟肽基因，并利用毕赤酵母表达系统实现二者在体外分泌表达，通过发酵罐发酵以期获得更高活性的防御素产品，为猪防御素的工程化生产奠定基础。本实验以健康猪新鲜骨髓为实验材料，以GenBank中报道的猪防御素的cDNA序列及表达载体pPIC9k多克隆位点为基础设计引物，其中上游引物含有EcoRI酶切位点，下游引物含有Not I酶切位点。采用RT-PCR技术扩增出PBD-1基因的cDNA序列，然后插入到pPIC9k的EcoR I和Not I位点，构建重组质粒pPIC9k-PBD-1；又根据毕赤酵母偏好性密码子设计引物通过搭桥PCR合成PBD-1基因，基因的N端引入α-信号肽Kex2和Ste13裂解位点，以保证产物具有天然的N端，两端引入EcoR I和Not I酶切位点。将合成目的基因片段克隆入pPIC9k构建重组表达载体pPIC9k-PBD-1。最后在修改两个信号肽的5’-UTR，去掉8个多余碱基，构建pPIC9k-PBD-1-E和pPIC9k-PBD-1(优)-E。用Sal I线性化两个质粒，采用电穿孔法转入毕赤酵母SMD1168。经过PCR检测筛选得到阳性克隆，再对发酵条件如：种子培养基的培养时间、接种时间、pH值、培养以及诱导时转数、DO、工业化培养基筛选等进行一系列的优化，最终使得发酵产物累计量达到最高值。 本研究通过对基因本身、启动子区域以及发酵条件的一系列条件优化，使得目的蛋白的表达量能够在发酵中得到最大量的积累。发酵结果表明抗菌肽浓度达到了238.5 mg/L，菌体湿重192.5 g/L。