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植物表皮蜡质是覆盖于陆生植物暴露于地面部分的脂类结构疏水层,此外还包括地下的木栓质基质、愈伤组织、花粉粒以及种皮中的脂类。蜡质的合成和分泌是在上表皮细胞中进行,并且有重要的生理生态学功能,包括防止非气孔性水分丢失、保护植物免受紫外线辐射及细菌和真菌的侵入。此外,花粉粒含油层中的蜡质对受精作用中花粉-柱头的信号识别也有重要作用。 近些年,尽管利用分子生物学的方法已经分离并鉴定了拟南芥和玉米中的一些蜡质合成相关基因,但是一些基因的生物学功能仍然不清楚,其中就包括GL1(Glossy1)同源基因家族。OsGL1(Oryza sativa GL1)是水稻种与蜡质合成相关的一个基因家族,包括11个与GL1同源的基因,分别命名为OsGL1-1~OsGL1-11。本研究采用RT-PCR、GUS染色以及亚细胞定位等方法对蜡质合成相关基因OsGL1-4的生物学特性进行了研究:通过反义RNA技术获得了蛋白表达量下调的转化植株,从转化植物的表型、花药发育过程等方面,以及结合其生物学特性推测蜡质合成相关基因OsGL1-4可能与花药发育过程中药壁组织的发育有关,花药开裂和柱头粘性,最终导致结实率下降。 本论文主要结果如下: 1、生物信息学分析表明,OsGL1-4位于水稻第2条染色体上,cDNA数据库中的序列号为:NM-001053994,基因座号为:Os02g0621300,全长为2481bp,ORF为1860bp,编码619aa的蛋白,分子量为71.46kD。OsGL1-4与位于水稻第4染色体的水稻蜡质合成相关基因OsGL1-7以及第1染色体上的OsGL1-5和拟南芥CER1同源性较高。蛋白保守区域分析表明,OsGL1-4属于脂肪酸羟化酶超家族成员。 2.构建了OsGL1-4∶GUS载体,通过对愈伤组织,根,茎,不同部位叶以及不同时期的小穗进行GUS染色检测,结果表明OsGL1-4在花药、叶片和愈伤组织中表达。 3.构建了由OsGL1-4的全长ORF序列与eGFP基因融合的瞬时表达载体,并转化水稻叶肉细胞原生质体进行亚细胞定位,结果表明,OsGL1-4定位于质体中。 4.构建了由OsGL1-4自身启动子驱动的反义RNA载体,采用农杆菌介导法转化粳稻品种中花11愈伤组织获得抗性植株。以Western blotting方法筛选出蛋白表达量下调的转化植株。同时,对其表型和细胞学观察发现OsGL1-4转化植株表现为花药弯曲、短小、花药壁开裂不正常、花粉育性降低和结实率下降。饱和授粉试验发现,转化植株柱头接受花粉能力下降。扫描电镜分析表明,转化植株的花药壁细胞长度缩短,花粉粒变小。 5.通过制作塑料半薄切片和超薄切片对OsGL1-4反义RNA转化植株的花药发育过程进行观察。结果显示,转化植株花药药室的绒毡层细胞在小孢子晚期提前降解,而药室内层细胞在花粉成熟期却依然清晰可见。而这些因素造成了花药药壁开裂受阻,从而导致转化植株结实率降低。这说明OsGL1-4可能参与绒毡层细胞的合成,并且在内层细胞的降解过程中起一定作用。