手足口病(Hand,foot，andmouthdisease，HFMD)是五岁以下儿童常见的病毒性疾病，目前对手足口病仍没有有效的疫苗和抗病毒药物。肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxsackievirusA16，CA16)是HFMD的两个主要致病原，前者造成重症的比例要高于后者，有一小部分患者甚至同时感染两种病毒。疫苗是控制传染性疾病的最有效措施，理想的HFMD疫苗，应是能同时预防EV71和CA16感染的双价疫苗。目前，针对EV71的灭活疫苗已经进入临床试验阶段，而针对CA16的疫苗研发处于起步阶段。本研究围绕CA16新型疫苗研发这一主线，开展了三部分工作:(1)CA16病毒衣壳蛋白定性和定量方法的建立;(2)CA16小鼠感染模型的建立;(3)CA16病毒样颗粒疫苗的表达、免疫原性及保护效果评价。　　本研究首先原核表达和纯化CA16的重组衣壳蛋白VP0、VP1和VP3，免疫动物制备了特异的多克隆抗体:抗VP0抗体、抗VP1抗体和抗VP3抗体，通过免疫荧光实验和Westernblot实验特异性检测CA16病毒，结果表明CA16病毒细胞株的衣壳蛋白由VP0、VP1和VP3或VP1、VP2、VP3和VP4组成，蔗糖梯度密度离心显示CA16的这些衣壳蛋白组成病毒颗粒。然后以纯化的重组蛋白VP0作为标准蛋白，以制备的抗VP0抗体为检测抗体，建立了CA16病毒的Westernblot定量方法。本部分为CA16病毒的鉴定与检测准备了必需的抗原和抗体，建立了病毒和疫苗的定量方法。　　缺乏CA16小鼠感染模型是研发CA16疫苗的一个瓶颈，本研究首先建立了CA16/SZ05腹腔感染1日龄ICR小鼠的模型，小鼠感染后表现出瘫痪和死亡等临床病症，死亡率在50％-70％之间，利用特异抗体在脑干检测到病毒抗原，检测各组织中病毒载量发现在CA16感染早期骨骼肌中病毒载量最高，而后期脑组织中病毒载量最高，显示CA16有神经嗜性。新生小鼠感染实验表明CA16/G08比SZ05毒力较强，接下来将G08在鼠细胞和小鼠体内适应传代，获得一个鼠适应性的突变株G08-MAV。与亲本株G08相比，G08-MAV对鼠细胞和小鼠的毒力增强，能有效感染鼠细胞L929，腹腔注射G08-MAV的7日龄ICR小鼠出现共济失调、瘫痪等典型神经症状和较高死亡率(71％)。进一步实验表明，腹腔注射G08-MAV能感染14日龄ICR小鼠。更重要的是，G08-MAV口服感染2-7日龄ICR小鼠造成瘫痪及死亡，G08-MAV口服或腹腔感染2-7日龄Balb/c小鼠也引起严重瘫痪和死亡。这些结果表明我们已成功建立了基于鼠适应病毒G08-MAV的小鼠感染模型，为评价候选疫苗的保护效果以及研究CA16的传播和致病机制提供了有效的平台。　　为研制针对CA16的基因工程疫苗，本研究利用重组的杆状病毒在昆虫细胞共表达P1和3CD制备CA16的病毒样颗粒(VLP)，生化试验和电镜分析发现病毒样颗粒主要由病毒衣壳蛋白VP0、VP1和VP3构成一个约30nm的球形颗粒。CA16-VLP免疫小鼠获得的抗体对CA16有较高的中和活性，更重要的是抗VLP血清对致死剂量同源和异源CA16病毒攻击的保护率分别为100％和88.9％，本研究说明CA16的病毒样颗粒产生的抗体有效地保护CA16的感染，为进一步开发兼抗EV71和CA16的双价手足口病疫苗奠定了基础。　　由以上研究我们可以得出如下结论:　　1)首先本研究原核表达并纯化了重组的CA16病毒衣壳蛋白，制备了针对CA16病毒衣壳蛋白的特异抗体，建立了定性和定量分析CA16病毒的方法。　　2)利用野生型CA16病毒建立了1-2日龄ICR小鼠的腹腔感染模型，利用鼠适应性病毒突变株建立了14日龄小鼠腹腔感染模型和2-7日龄小鼠口服感染模型。　　3)利用昆虫-杆状病毒表达系统制备CA16的病毒样颗粒，在小鼠体内诱导高效价中和抗体的产生，在小鼠感染模型上能有效保护CA16的感染。