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IgG作为连接先天性免疫与获得性免疫的功能分子,是抗原与受体及效应分子相互作用的桥梁,其在血清中含量最高,同时半衰期最长,主要是由脾脏以及淋巴结中的浆细胞合成。与抗原分子特异性结合形成抗原-抗体复合物,改变Fc段的构象,暴露相应的补体结合位点,使得C1q与之结合,进而激活补体系统;此外,IgG可通过其Fc片段特异性识别细胞表面的Fc受体,从而产生多种不同的生物学效应,主要包括:病毒中和作用、ADCC作用、胞外杀伤及免疫炎症、吞噬调理作用等。IgG-Fc段作为抗体分子与细胞及效应分子相互作用的重要结构域,介导细胞免疫应答反应,对抗体自身的抗原性起着决定性作用。IgG重链恒定区尤其是Fc段基因在不同动物间相对保守,因此分析IgG重链Fc基因在不同动物间的同源性,可以更加精确地反映不同动物抗体间交叉免疫原性的差异。本试验选用貉IgG重链为研究对象,研究内容主要分为三部分:第一部分貉IgG重链基因序列测定及分析根据NCBI上已公布的犬、水貂IgG重链基因的保守区域设计引物,从病貉的脾脏内提取RNA。通过Race技术首次成功克隆貉IgG重链全基因,序列全长1474bp,编码491个氨基酸。利用多种软件对其IgG重链基因进行生物信息学分析和遗传进化分析。核苷酸分析结果显示貉与犬IgG间亲缘关系最近,同源性为92.6%,与猫的同源性为83.0%,与水貂的同源性为82.8%,与人的同源性为75.9%,与鼠的同源性为68.2%。氨基酸序列进行比较分析发现,貉与犬同源性为89.6%,与水貂的同源性为77.2%,与人的同源性70%左右,与鼠在60%左右。通过Swiss-model同源建模,对貉、犬IgG三维晶体结构进行预测,得出貉、犬IgG三维结构均基于人类IgG分子建模,立体结构的相似度保持在70%左右。关键氨基酸差别和三维空间结构的不同是IgG的遗传变异所在。第二部分不同种属动物间IgG免疫原交叉性分析不同种属动物的IgG三维立体结构具有较高的相似性,同时其各自Fc段氨基酸残基相对保守,预示了不同动物IgG与不同动物的酶标二抗间存在交叉反应,但其交叉反应强度与IgG-Fc段的结构密切相关。通过dot-ELISA及WesternBlot试验,检测了小鼠、鸡、鸭、人、貉、兔、水貂血清抗体分别与抗犬、抗兔、抗鼠和抗人四种酶标二抗间的交叉反应性,同时分析了貉IgG-Fc融合蛋白与抗犬二抗间的免疫原交叉性。结果表明,不同动物的IgG之间,或多或少都存在一些交叉性。不同纲目之间的动物也可有一定程度的交叉免疫反应,例如鸡与犬二抗间有相对明显的交叉反应,而与兔、鼠、人二抗间几乎不存在免疫交叉。第三部分貉IgG-Fc多肽生物功能活性分析借助文献及在线软件分析貉Fc区功能活性位点,人工合成貉IgG-Fc区多肽NTVSITCLVK(N10K)、PSVYVLPPSQ(P10Q)及阴性对照多肽MSTAVSKCAT(NC),Fc多肽在不同浓度下与小鼠外周血淋巴细胞共培养18h检测上清液中细胞因子含量(TNF-α,IL-1β,IL-6),发现在浓度为10μg/m L时,多肽N10K可以刺激淋巴细胞分泌更多的TNF-α(271.95pg/m L),IL-1β(27.42pg/m L),而多肽P10Q可以促进淋巴细胞产生较多的IL-6(35.51pg/m L)。初步确定貉IgGFc区多肽P10Q及N10K对外周血淋巴细胞的体外免疫诱导功能活性,同时为今后貉源疾病预防及治疗奠定基础,为研究多肽疫苗提供了实验依据。